核酸 适体 是通过体外筛选获得的，具有高亲和力、高选择性的寡核苷酸片段，通常被用作检测探针和疾病治疗。研究者们为了将核酸 适体 转化为药物分子进行了许多努力，但是能够阻断靶标相互作用的 适体 药物开发仍然面临着许多挑战。目前报道的功能 适体 的开发通常需要亲和 适体 的获取和功能筛选两步进行，这不仅耗时，而且亲和筛选可能缩小候选药物的范围。此外， 适体 通常需要繁琐的后修饰来克服药代动力学限制，这通常会影响 适体 与靶标的结合亲和力。

针对以上功能核酸适体药物开发的瓶颈问题，2024年8月21日，我 院 天然药物 及 仿生药物全国重点实验室 张力勤 研究员 团队 与合作者 在 Journal of the American Chemical Society 杂志发表了题为 “ Functional Aptamers In Vitro Evolution for Intranuclear Blockage of RNA-Protein Interaction ”的研究论文。 文章 提出了一种新的 功能核酸适体 体外筛选平台 (FAIVE)， 该平台将亲和 适体 获取与功能筛选相结合，并在此过程中引入化学多样性 修饰 。以 HIV-1 病毒细胞核内 Tat蛋白和TAR RNA的RNA-蛋白相互作用 为模型 ， 利用 FAIVE 平台开发了 具有显著细胞内阻断 相互 作用的功能性 核酸 适体。该研究还探索了脂质纳米颗粒递送系统，以提高细胞内递送效率，将 核酸 适体 靶向潜力扩展到更广泛的细胞 质 和 细胞 核内区域 。

研 究 内 容

1. 功能核酸 适体 体外筛选平台的建立

初始DNA文库由A、C、G以及C5-乙基-2′-脱氧-尿嘧啶( EdU ）4种碱基组成，之后通过乳液PCR将预富集后的DNA文库制备成单克隆的 适体 微珠 ，利用“点击化学”反应将3-（2-叠氮基乙基）吲哚与 EdU 碱基上的乙基偶联，形成色氨酸侧链官能团，提高了文库的疏水性。在筛选过程中，使用荧光-淬灭对标记的 TAR rna- Tat多肽 复合物与 适体 微珠孵育，具有阻断作用的 适体 微珠 能够破坏TAR RNA - Tat多肽复合物并恢复荧光，使用流式细胞分选仪对荧光微珠进行收集。随后，对收集的微珠进行扩增。经过几轮重复，具有阻断相互作用的 适体 序列被富集 （图1） 。

图1 阻断TAR RNA-Tat多肽相互作用的功能核酸 适体 体外进化(FAIVE)平台 （图片选自文章）

2. 功能核酸 适体 性能评估

在用FAIVE平台进行功能化 适体 筛选的同时，研究者同时以TAR RNA和Tat蛋白为靶标，进行了基于亲和力的SELEX筛选。对筛选后序列进行分析，选取前96个簇中的序列进行 适体 的性能评估。通过BLI技术测定 适体 与相应靶标的结合亲和力，使用竞争取代分析测定 适体 的阻断作用。研究者发现，使用SELEX筛选得到的 适体 序列具有较 好的结合亲和力，但具有阻断作用的功能核酸 适体 较少。而基于FAIVE平台得到的 适体 具有 更 优越的阻断作用，这显示了FAIVE平台强大的功能 适体 开发潜力（图2）。

图 2 核酸 适体 结合亲和力与阻断作用性能评估 （图片选自文章）

3. 核酸 适体 递送体系的建立

为了评估 适体 药物的细胞内阻断效率，研究者采用中性胞苷脂材(DNCA)/阳离子脂材(CLD)脂质纳米颗粒进行 适体 的细胞内递送。DNCA作为一种有效的中性转染脂材，可以通过H键和π-π堆积与 适体 相互作用。CLD/DNCA的联合使用减少了CLD阳离子脂材的用量，降低了细胞毒性，并能提高 适体 的细胞内递送效率。最重要的是，脂质体纳米粒子的使用将核酸 适体 靶向潜力扩展到更广泛的细胞质和细胞核内区域 （图3） 。

图 3 核酸 适体 的脂质纳米颗粒递送系统 （图片选自文章）

4. 功能核酸 适体 在细胞及假病毒中阻断作用的验证

研究者使用 双 萤光素 酶报告基因 模型系统探究候选 适体 是否能够调节细胞内TAR RNA-Tat蛋白的相互作用。在该系统中，TAR RNA与Tat蛋白的结合可以促进下游萤光素酶基因的转录，细胞产生的 萤 光素酶活性高低直接指示Tat蛋白的反式激活作用的强弱。研究发现候选 适体 的存在可以抑制细胞胞质内 萤 光素酶的表达，抑制率可以达到70%。然而在HIV-1病毒中，TAR RNA和Tat蛋白之间的相互作用仅发生在细胞核内，随后病毒整合到宿主细胞基因组并启动下游转录过程。因此， 适体 只有通过进入细胞核，成功阻断TAR RNA-Tat蛋白相互作用，才能发挥其抑制功能，从而阻止病毒感染。因此研究者使用 VSVG/HIV-1假病毒模型 评估所选 适体 在阻止细胞核内TAR RNA-Tat蛋白相互作用方面的功效。研究发现，测试的2条 适体 均能显示出10%至40%的剂量依赖性抑制率。这些结果证实了 适体 对TAR RNA-Tat蛋白相互作用的有效阻碍（图4）。

图 4 候选 适体 在细胞及VSVG/HIV-1假病毒模型中阻断作用的验证 （图片选自文章）

该研究建立了一个强大的体外筛选平台以促进功能核酸 适体 的发现，对于开发抑制大分子相互作用的核酸药物提供了一个成功案例。通过揭示 适体 与其指定靶标之间复杂的相互作用，这项工作将为 适体 筛选策略提供宝贵的见解。在脂质纳米颗粒等递送系统的不断完善下，潜在靶标范围的界限将被扩大，得以促进药物发现的快速发展。这一成就不仅有助于更深入地了解 适体 在细胞内的作用机制，而且为多种疾病的治疗带来了希望。

北京大学药学院的张力勤研究员、杨振军教授，陕西师范大学的张志琪教授，北京协和 药物所 的郭颖教授为论文的通讯作者。北京大学药学院博士后李俊为论文的第一作 者，团队成员姚盼竹、赵旭洋、刘西洋、刘钦国、魏同萱、宣弘、卞思琪以及协和医学院的唐克博士为该研究做出了重要贡献。该研究获得国家重点研发计划、国家自然科学基金、医学科学创新基金等项目的支持。

论文链接： https://doi.org/10.1021/jacs.4c08824

第一作者简介

李俊， 陕西师范大学博士， 北京大学药学院博士后，获得国家博士后C类资助。以第一作者或共同作者身份在 J. Am. Chem. Soc. , Anal. Chem., Anal. Bioanal . Chem., ACS Sens., Sens. Actuators B Chem. 等杂志上发表多篇学术论文。 研究方向为药物筛选模型和核酸适体药物功能化筛选 。

张力勤研究员简介

张力勤 ， 博士 ， 北京大学药学院助理教授、博士生导师 ， 药物分析学系副主任， 天然药物 及 仿生药物全国重点实验室研究员、课题组长 。 2009年毕业于北大药学院本硕六年制药学专业， 2016年获得佛罗里达大学化学博士学位，曾在斯坦福大学医学院从事博士后研究工作，并在美国赛默飞世尔科技公司基因科学部担任高级科学家，2021年回国工作。 主持基金委优秀青年基金、面上 项目 ，科技部重点研发计划课题、参与基金委重大科研仪器研制项目。担任 Science China Chemistry 杂志青年编委。在 Nat. Comm. , J. Am. Chem. Soc., Angew . Chem. Int. Ed., 等顶级期刊上发表SCI研究论文超过 40 篇。研究方向聚焦于多元功能核酸分子工具的构建开发及其在药物筛选、生命分析和疾病诊疗中的应用。

杨振军教授简介

杨振军， 北京大学医学部药学院教授，天然药物及仿生药物 全 国重点实验室PI。1987年获得北京医科大学药学专业学士学位，1998年在该校获药物化学专业理学博士学位, 2000 - 2002年在美国佐治亚大学药学院从事博士后研究, 2008年起任现职。曾任药物化学系副主任、国家自然科学基金委员会化学学部化学生物学流动项目主任，现任中国化学会化学生物学和中国药学会药物化学专业委员会委员。发表研究论文160多篇，申请和授权专利26项。负责科技部新药重大专项、973项目课题、重大863项目课题、自然基金委重点课题子课题和面上课题多项。曾获教育部自然科学一等奖1项、二等奖2项，国家自然科学二等奖1项。主要研究方向：1. 核酸药物的化学修饰和新型靶向制剂研究；2. 基于核酸 适体 的疾病早期检测新技术研究；3. 环核苷酸类信使分子化学生物学研究；4. 核苷类抗病毒药物研究。

天然药物 及 仿生药物全国重点实验室 供稿