全外显子组测序 (Whole Exome Sequencing, WES ) 是使用探针对人类基因组中2万多个基因的外显子区进行捕获后进行高通量测序，具备检测范围广、检出率高、数据重分析价值高和能进行新致病基因找寻的优势，目前已被多项研究证实可做为疑难案例的一线分子诊断工具。随着WES技术的推广，数据分析和解读能力成为了临床WES的最关键因素。而特殊的临床案例不仅需要常规的生物信息分析和解读，还需借助个性化分析来答疑解惑。

真实案例，WES协助临床分辨病因

2018年国庆节，石某 (先证者，男孩，8岁) 在父母的陪同下来到吉林某院就诊，父母非近亲结婚、表型正常，而石某临床疑似自闭症，同时伴有尖耳、大眼、后颈扁平、颅缝早闭、自言自语、贫血、瘦弱等表型。早在2010年石某半岁就诊时，医生就曾将样本送检至北京某检测机构，但未查出明确致病原因。时隔8年，石某父母为了备孕二胎再次就医，这一次医生结合8年前的检测结果选择了送检华大基因进行全外显子组测序。

华大的遗传分析团队对石某的全外显子组数据进行分析解读后发现， 石某的致病原因极有可能是 SBDS 基因纯合突变 (NM_016038.2：c.258+2T>C) ，评估依据如下：

① SBDS基因所关联的疾病与患者表型相关度高。 其突变导致的Shwachman-Diamond综合征为常染色体隐性病，发病率很低，目前全世界范围内仅有数百例案例被报道，典型症状包括胰腺外分泌功能障碍相关的吸收不良、营养不良和生长障碍，单一或多种血细胞减少血液异常并骨髓增生异常综合征和急性粒细胞白血病，以及骨畸形、神经异常等 (OMIM：260400)；② 检出的SBDS基因c.258+2T>C致病性明确 [1-6] ，并在该疾病的患者中属于相对常见的致病突变。根据ACMG突变解读指南，c.258+2T>C为致病突变 (ACMG证据条为：PVS1，PS3，PM3，PP1，PP5)；③ c.258+2T>C为纯合突变，符合常染色体隐性遗传模式。

结合石某的临床表型、突变致病性信息和突变在先证者中的携带状态，这三方面的信息都支持该突变的致病性，初步看来这“似乎”是个很明确的阳性案例。

结论存疑，“纯合突变”是特例还是意外？

行业内有经验的遗传分析师都清楚，如果类似的罕见单基因病致病突变人群发生率极低，那么非近亲结婚的家系中碰到纯合突变的可能性则会更低。因此华大基因遗传分析团队推测先证者石某的检测结果另有蹊跷。

华大基因遗传分析团队没有止步于此，在使用华大自主开发的CNV检测流程进行深入分析验证后，结果发现 先证者石某不仅存在SBDS:c.258+2T>C的点突变，而且存在外显子的杂合缺失，位置恰巧发生在点突变所在的二号外显子。 因此，之前的数据分析结果形成了“纯合”的假象。

随后，华大团队对先证者石某的父母样本进行了定量PCR验证，在石某和他母亲的样本均验证出SBDS二号外显子缺失突变 (图1)，这也表明了石某的SBDS二号外显子缺失突变来源其母亲，验证了假设的真实性。

图1. 家系SBDS基因二号外显子qPCR验证结果

疑点频现，母亲Sanger结果不符合遗传规律？

但奇怪的是，家系验证c.258+2T>C Sanger的结果却不符合家系共分离规律。石某父母的样本Sanger结果显示：父母二人均为SBDS c.258+2T>C杂合突变。 但母亲二号外显子有缺失，且表型正常，理论上她不应携带SBDS c.258+2T>C。 虽然证实了一个假设却出了一个新的疑点，这又该如何解释呢？

图2.家系SBDS c.258+2T>C Sanger验证结果

通过查询大量的文献和比对遗传病的权威数据库， 华大团队发现SBDS存在一个假基因SBDSP，推测是假基因SBDSP的干扰，导致了母亲Sanger结果异常。 假基因是具有与功能基因相似的DNA序列，但通常不能产生功能性蛋白质产物，而SBDS假基因SBDSP与SBDS的转录本序列具有97％的相似性。图3可以直观的说明假基因如何干扰Sanger测序结果。

图3. 家系成员SBDS基因型示意图

验证SBDS二号外显子缺失突变的qPCR引物位置可识别真假基因，所以可确定母亲和先证者石某的二号外显子缺失可信；而sanger验证所用引物的序列不能区分真假基因，通过核查Sanger验证峰图，发现存在与假基因复合的SNP位点。

根据上述证据，该案例推断是 先证者石某为SBDS基因二号外显子缺失和c.258+2T>C复合杂合，先证者父亲为SBDS基因的c.258+2T>C杂合突变，先证者母亲为SBDS基因的二号外显子缺失杂合突变。

这个真实的临床案例通过遗传分析师对样本负责任的态度和抽丝剥茧的分析，对不符合遗传学规律的异常点进行不余遗力的逐步排查，最终得出了真实可靠的结果，辅助临床疑难病症查明病因，也为石某家庭孕育健康下一代提供了科学依据。

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