研究背景：

工欲善其事，必先利其器。科学仪器是人类认识世界，探索未知的重要工具。门捷列夫曾提到“科学是从测量开始的”，仪器创新是科学突破的重要基石，也是我国迈向世界科技强国道路，发展新质生产力的重点领域。X射线衍射（1914，1915年诺贝尔物理学奖），超分辨率荧光显微镜（2014年诺贝尔化学奖）与冷冻电镜（2017年诺贝尔化学奖）等技术使得我们能够以前所未有的精度研究单个细胞内不同蛋白、细胞器等物质的结构与功能，极大地推动了生命科学与医学的发展，但却始终只能覆盖很小的视野范围，如同管中窥豹般难以在活体环境下对大量细胞进行动态观测。CT成像（1979年诺贝尔生理学或医学奖）与磁共振成像（2003年诺贝尔生理或医学奖）能够提供极大的成像视场，在活体的宏观尺度下研究不同器官的异质性，已经广泛应用于临床医学领域，为人类生命健康做出了突出贡献，但其成像精度却远远难以达到单细胞尺度。

细胞是生命活动的基本单位。每时每刻，人体内都在上演着大量不同类型细胞间交互作用所形成的交响曲。然而，在这一连接微观与宏观之间的介观尺度上，却存在巨大的技术空白，使得当前研究难以在哺乳动物的活体环境器官尺度下同时观测大量细胞在不同生理与病理状态下的时空异质性，极大地限制了脑科学、免疫学、肿瘤学、药学等学科发展。仅以脑科学为例，大量神经元间的相互连接和作用，进而涌现出如智能、意识等功能，厘清神经环路的结构和活动规律是解析大脑工作原理的必由之路。然而具备单神经元识别能力的传统显微镜往往只具备毫米级视场，仅能覆盖小鼠单个或几个脑区实现单个平面的神经信号动态记录；功能核磁虽然能够实现三维全脑范围观测，但空间分辨率却远不足以识别单细胞。因此，2013年启动的美国脑计划也将“大规模神经网络记录技术”列为九大资助领域之一。同样，对于肿瘤学而言，只有兼具大视场与高分辨才能全景式地捕捉肿瘤发生发展的完整过程，从而更精准地研究不同药物反应，发现新的药物靶点。

十年磨一剑：

瞄准这一国际前沿难题，清华大学戴琼海院士团队早在2013年就获得了国家自然科学基金委重大科研仪器研制项目支持，在国际上率先开展了介观活体显微成像领域的研究，于2018年成功研制了国际首台亿像素介观荧光显微仪器RUSH，能够同时兼具厘米级视场与亚细胞分辨率。尽管这一系统被国际同行誉为介观显微成像领域的先驱，但是由于仪器复杂昂贵，在当时仅能被少数科学家使用。与此同时，RUSH系统仍然面临一系列瓶颈，包括：如何利用二维传感器实现高速三维成像；如何避免激光长时间照射所引起的细胞损伤（即光毒性）从而实现长时程高速的观测；如何克服复杂成像环境导致的光学像差与背景干扰；如何提升弱光条件下的成像信噪比；如何高效处理大规模介观数据等等。每一项技术瓶颈本身都是生物医学成像领域的国际难题，而如何在同一系统上同时解决这些活体成像壁垒，则变得更为挑战。

“世之奇伟、瑰怪，非常之观，常在于险远，而人之所罕至焉，故非有志者不能至也”。在之后的6年里，戴琼海院士带领的成像与智能技术实验室，瞄准活体介观显微成像的高峰，攻坚克难，持续攻关这些国际前沿难题，先后提出了扫描光场成像原理，数字自适应光学架构，虚拟扫描算法，共聚焦扫描光场架构，自监督去噪算法等关键理论与技术，相关成果均发表于Cell，Nature，Nature Biotechnology，Nature Methods等国际期刊，逐一解决了介观活体显微成像中一系列壁垒，为新一代介观活体显微仪器奠定了基础。正由于所有技术研发的初衷，都有着同一个目标，即实现真正实用的活体介观显微观测，这些技术能够完美地在同一系统架构上融合，并带来整体性能的颠覆性提升。

图1 活体介观成像的技术空白

铸大国重器：

2024年9月13日，清华大学戴琼海，郭增才，吴嘉敏作为共同通讯在Cell上发表的最新工作 Long-term mesoscale imaging of 3D intercellular dynamics across a mammalian organ ，宣布了新一代介观活体显微仪器RUSH3D系统的问世，在兼具厘米级三维视场与亚细胞分辨率的同时，能够以20Hz的高速三维成像速度实现长达数十小时的连续低光毒性观测。相比于目前市场上最先进的商业化转盘共聚焦显微镜而言，其在同样分辨率下的成像视场面积提升了近百倍，三维成像速度提升了数十倍，光毒性降低了上百倍（有效观测时长提升百倍）。这一前所未有的跨空间和时间的多尺度成像能力，为复杂生物过程的研究提供了一个全新的视角。通过该系统，研究人员可以首次以全景方式动态观测哺乳动物器官尺度细胞精度的组织异质性，从而为活体大规模多样化细胞间的交互行为研究打开了大门。

交叉研究团队利用RUSH3D在脑科学、免疫学、医学与药学等多学科展示了令人瞩目的成果。首次在活体小鼠上以单细胞分辨率实现了覆盖大脑皮层2/3层的高速三维观测，捕捉了多感官刺激下皮层各脑区的响应模式，连续多天以单神经元精度追踪大规模神经响应。首次观测到了急性脑损伤后多脑区的免疫反应，发现大量中性粒细胞从非血管区域往脑内的迁移与回流过程。首次在小鼠免疫反应过程中同时观测到了淋巴结内多个生发中心的形成过程，以及T细胞在不同生发中心之间的迁移现象。这些初步实验仅仅展现了RUSH3D应用的冰山一角，充分展示了RUSH3D为神经科学、免疫学、肿瘤学、药学等领域的前沿研究所带来的广阔应用前景。该仪器的研制与产业化（浙江荷湖科技有限公司）填补了对复杂生命现象介观尺度活体观测的空白，推进了新型计算成像理论与关键技术的进步，极大地提升了我国高端科研仪器的研究和应用水平，为揭示神经、肿瘤、免疫新现象和新机理提供了新的杀手锏，使得我国生命科学家、医学家能够率先使用我国自主的高端仪器设备来解决重大基础研究问题。

图2 RUSH3D系统图

计算成像，另辟蹊径：

计算成像是颠覆“所见即所得”这一古已有之观点的新概念。利用计算编码、计算采集等多为多尺度计算方法，计算成像从人类视觉的“所见即所得”发展为机器视觉的“所算即所得”，实现了超快帧率、超清分辨率、超高信噪比等突破采集硬件物理极限的一系列新特性。RUSH3D系统集成了团队前期一系列成像与智能技术理论和关键技术成果，基于扫描光场成像原理，能够实现轴向400微米范围的高速三维成像的同时并具备低光毒性。针对光学像差会严重影响系统成像的分辨率， RUSH3D通过获得全视场超精细的四维空间角度数据，构建了基于波动光学的数字自适应光学架构（wDAO），无需在光学系统中增加额外的波前传感器或者空间调制器，在后端即可完成大视场多区域自适应光学像差矫正，从而提升大视场复杂环境三维成像的空间分辨率以及信噪比。这一设计使得仅需常规尺寸物镜，就能有效克服空间非一致的系统像差和样本像差难题，实现了全视场内均一高空间分辨率的十亿像素成像，显著降低介观成像系统尺寸与成本，使得高分辨活体介观显微成像系统变得更加广泛可及。除此之外，活体荧光成像中背景荧光严重影响了成像的信背比，RUSH3D采用多尺度去背景算法实现背景信号和在焦信号的分离，精准的滤除散焦背景，从而提升成像信背比，恢复淹没在荧光背景中的荧光信号。进一步与共聚焦扫描光场融合，将能在具备高通量介观观测能力的同时，实现共聚焦的成像保真度。

图3 RUSH3D成像效果

开创性成像技术，实现高效脑科学研究：

RUSH3D通过其跨时空的多尺度成像能力，极大地拓宽了科学家对大脑的认知。大脑皮层的神经元网络被认为是高等动物神经系统中十分重要而又复杂的信息处理中心，是产生生物智能乃至意识的关键神经网络区域。以往研究发现，皮层功能分化形成了调控各种信息的皮层区域，大脑各皮层区域间神经元的功能性活动和信息交流是皮层发挥功能的重要方式。然而，由于观测技术限制，目前大部分研究只能同时记录实验动物中一个或几个皮层区域的神经元活动，难以进一步研究皮层神经元网络的联合动态变化。通过RUSH3D大视场、三维高分辨率、高帧率的成像优势，交叉团队开创性地实现了对头固定下清醒小鼠背侧皮层17个脑区中十万量级神经元的长时间记录，并且能够对同一群神经元进行跨天的多试次记录。运用此记录手段，证实了响应感觉刺激、调控运动的神经元并非只存在于单一的感觉皮层、运动皮层，而是广泛存在于皮层各个区域，但各个区域神经元对感觉信息编码、整合、区分的能力存在差异。进一步发现自发运动行为发起时，小鼠皮层神经元网络由尾侧向鼻侧传导的发放模式。这一结果提示视觉、触觉等感觉皮层神经元的信息整合和全皮层范围的信号扩散可能是引起自发运动的关键因素。在此基础上，RUSH3D有望首次实现解析全背侧皮层三维神经功能连接，即根据RUSH3D采集到的三维神经元群体在不同任务、不同刺激下的活动进行功能聚类，进而描绘百万神经元三维功能连接图谱，帮助揭示大脑意识奥秘，推动对大脑退行性疾病的研究，并进一步促进脑启发人工智能的研究。

图4 全脑皮层神经成像

突破活体成像瓶颈，推动免疫学新发现 ：

RUSH3D系统为研究大规模细胞交互提供了前所未有的工具。例如，生发中心（Germinal center, GC）是被抗原激活后的B细胞在趋化作用引导下聚集形成的结构。由于受到视场和拍摄时长的限制，免疫细胞如何参与多个GC生成以及如何在多个GC间进行迁移的过程从来没有被连续记录过。团队利用RUSH3D对小鼠腹股沟附近淋巴结在免疫反应85个小时左右进行长达了十数小时的高速三维成像，完整记录了B细胞参与多个GC生成的过程。于此同时，同时观测到在免疫反应145个小时GC已经完全形成之后，一些T细胞在多个GC之间完整迁移的过程，预示了T细胞可能参与了GC之间的信息交流和传递。RUSH3D首次实现了对全器官尺度免疫反应的活体连续观测，特别是从肿瘤发生开始到免疫应答、肿瘤生长的全过程，首次完整揭示了肿瘤产生的免疫活化反应。RUSH3D对信使T细胞在不同生发中心之间交流信息的观测有望揭示免疫新机理，首次从介观活体角度揭开肿瘤转移之谜。

跨尺度精准解析，医学研究的革命性工具：

跨时空的多尺度成像能力使得RUSH3D极大地提升了实验效率。例如，药物筛选实验能够在单次实验中显著提高效率，免去多次试验的需求。同时，由于RUSH3D可以提供足够的数据进行统计分析，跨个体差异可以在一次实验中得到有效缓解。此外，诸如肿瘤转移等稀有事件，在RUSH3D的观察中将不再是随机发生的偶发事件，而是常规可见的现象。凭借其低光毒性三维观测的优势，该系统还能够同时观察到细胞间的长距离通信，并通过长时间追踪数百万个细胞，揭示集体细胞行为的物理规律和功能涌现的机制。作为RUSH3D在医学领域的初探，研究人员首次观测到了急性脑损伤后整个大脑皮层范围内的中性粒细胞迁移活动。当小鼠的脑部受到撞击以后，大量的中心粒细胞从血管周边非血管区域流出进入脑实质，也有极罕见的细胞从脑实质回流到血管里，这意味着有些细胞可能通过类淋巴系统进入脑实质，并且会流回血管中将信息传递到生物体的其他地方。值得注意的是，上述对脑损伤修复过程的介观尺度活体长时程观测在国际上属于首次，RUSH3D促使的对脑损伤中免疫细胞的深入解析有助于开发特定疗法避免急性脑损伤后组织水肿带来的脑功能缺失难题，并可预见在广泛的医学领域提供新视角。

科技成果转化，守护人民健康：

基于该系列成果的核心专利已于清华大学转化成立了国产自主先进显微仪器公司浙江荷湖科技有限公司，致力于国产自主可控具备国际领先性能的高端光学显微镜以及其在生命科学等领域的前沿应用。已经支撑清华、北大、北航、北师大、解放军总医院、同济医院等国内高水平科研机构在肿瘤学、免疫学、脑科学等不同领域开展了20余项创新性生命科学研究，服务于生物制药领域。其中典型案例如清华大学俞立教授团队利用该仪器首次在哺乳动物上发现了新细胞器“迁移体”在肿瘤与免疫中的生成过程与功能，为肿瘤早期诊断和治疗提供了新路径；同济大学附属同济医院杨长青教授团队利用该仪器揭示了Mas信号在药物性肝损伤进程中的关键地位及核心机制，为药物干预新靶点的开发提供了重要的数据支持；华中科技大学同济医学院王伟教授课题组正在使用RUSH3D仪器探索针灸的神经环路基础；清华大学时松海院士，刘嘉教授等课题组正在使用RUSH3D仪器探索意识的生物学基础等等。

清华大学自动化系博士后 张元龙 ，深圳国际研究生院博士生 王鸣瑞 和基础医学院博士生 朱齐禹 是本文的共同一作，清华大学自动化系 戴琼海 院士、 吴嘉敏 副教授，基础医学院 郭增才 副教授为本文的共同通讯作者， 郭钰铎，刘波，李嘉敏，姚啸，孔垂，张亿，黄予超，祁海 参与并作出重要贡献。该工作得到了国家自然科学基金委、国家科技部重点研发计划、以及清华大学Brain-X项目的大力支持。