原标题：我们离结核mRNA疫苗还有多远?

去年七月， BioNTech 宣布将在2022年开始结核分枝杆菌mRNA疫苗的临床试验 ，仅仅 距该项目启动过去2年，这项研究计划由盖茨基金会资助。让人感到意外的是，实际上，早在十八年前，也就是2004年，就有人尝试用mRNA技术来制备 TB mRNA疫苗 ，并且证实在小鼠模型中能够诱导产生适度但是分成显著的保护效果 （ modest but significant protection ）。mRNA技术在新冠病毒疫苗研发上的巨大成功，使得人们对成功开发TB mRNA疫苗给予极大的信心和期盼。

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居高不下的感染人数和死亡人数

结核病（ tuberculosis ，TB ）是由结核分枝杆菌（ Mycobacterium tuberculosis ）引发的慢性传染病。Mtb是一种兼性胞内寄生菌，其能够运用多种策略干预宿主细胞的正常功能从而逃逸宿主免疫反应，进而实现其在宿主细胞的长期存活。据估计， 世界上四分之一的人口感染过结核分枝杆菌，处于潜伏感染 ，由于免疫力降低，例如艾滋病毒感染或糖尿病，约有5-10%潜伏感染可能发生活动性结核病 【1】 。

WHO公布的2019年全球死亡主要原因中，由于结核病引发的死亡排名第13位，位于传染病引发的死亡原因之首 ，远高于由艾滋病引发的死亡。更加糟糕的是， 从2016年到2019年，全球每年结核病新增确诊人数在直线上升 。从2019年到2020年，新冠疫情的爆发导致新增确诊病例数发生下降18%（ 从710万到580万 ），但是这是由于新冠疫情对结核病诊断医疗服务的挤压以及病人前往医院进行诊断治疗意愿的下降所导致的，并非真实新增结核病感染人数 [2] 。 在国内局部地区前几年还发生过结核病感染群体性事件 ，结核病每年居高不下的新增病例和死亡人数给全球公共卫生带来持续多年的压力。

结核病引发的死亡人数和新增确诊病例居高不下 停滞不前的疫苗和药物研发

在2015年， WHO制定雄心勃勃的战略目标，希望在2035年彻底消灭结核病 ，这只能靠有效的疫苗阻断结核病传播来实现。 当前唯一被授权使用的疫苗是卡介疫苗BCG，它是一种牛分支杆菌制成的减毒疫苗，1921首次用于人体，距今已有百年的历史 ，可以说是人类历史上使用次数最多的疫苗。WH0建议，在结核病高度流行的区域，新生儿应该尽早接种卡介苗。对于青少年和成人来说，卡介苗保护效果有限。即便已接种过卡介苗，当吸入的结核菌过多，或者自身免疫力低下时，依然会发病。因此，靠现有的卡介苗，显然无法阻断结核病在全球范围内的流行。

当前治疗药物敏感菌 抗结核一线药物 由 异烟肼 （ INH ）, 利福平 （ RIF ）， 乙胺丁醇 （ EMB ）， 吡嗪酰胺 （ PZA ）组成。治疗耐药菌感染的二线药物包括靶向DNA解旋酶的喹诺酮类抗生素，靶向蛋白合成的氨基糖苷类抗生素以及环肽，靶向细胞壁的硫代酰胺类药物以及环丝氨酸。尽管化学药物疗法在治疗药物敏感菌（ drug-susceptible TB fection ）引发的结核病时，非常成功，但是依然存在明显的短板，因为化学疗法最少需要6个月的连续治疗，时常伴随着药物引发的副作用，而且也是耐药菌产生的主要原因。更加重要的是， 多重耐药结核菌MDR （ multidrug-resistant，对NIH和RIF耐药的结核菌 ）和 广泛耐药菌XDR （ extensive drug-resistant，对NIH，RIF，喹诺酮以及任何二线药物耐药的结核菌 ）的出现急剧增加结核病治疗的复杂性和成本，威胁到现有结核病药物治疗的有效性。此外，现在临床使用的大多数抗结核药物都是以增殖期的结核分枝杆菌为靶标，然而在体内存在的结核持留菌，代谢处于几乎停滞状态，不容易被药物杀死，能够长期存活，这是结核病迁延和复发的主要原因。

结核病治疗历史进程中主要发现和进展时间线[3]

从上世纪五六十年代，发现抗结核一线药物以后，在相当长的一段时间内，几乎没有找到任何有显著疗效的抗结核药物。到现在，我们预防结核病的疫苗还是一百前使用的，一线抗结核药物也是六十七年前发现的。 目前处于临床一期的结核疫苗有BCG重新改造疫苗，病毒载体疫苗，蛋白亚单位疫苗 。对于控制结核病的全球流行，应对耐药结核菌带来的巨大压力，研发新型抗结核疫苗和药物已经到刻不容缓的地步。

处于临床一期的结核分枝杆菌在研疫苗，数据来自2021年结核疫苗研发管线报告 TB mRNA疫苗初试

在2004年， Ricardo E. Tascon 在 Infection and Immunity 上面发表文章： RNA Encoding the MPT83 Antigen Induces Protective Immune Responses against Mycobacterium tuberculosis Infection ， 首次报道使用mRNA疫苗诱导机体产生对内寄生菌的免疫抵抗力 。MPT83是结核分枝杆菌在感染期间产生的主要抗原，研发人员使用体外合成的编码结核分枝杆菌MPT83抗原的RNA在小鼠体内成功触发特异性的体液免疫和细胞免疫，赋予小鼠中等程度但是非常明显的抵抗结核分枝杆菌感染的保护效力。

比较MPT83DNA疫苗和RNA疫苗抗原表达效率

研究人员发现，MPT83DNA疫苗免疫小鼠，接种完成后，第50天，在肌肉细胞内仍旧可以观察到转录出来的MPT83 mRNA。但是，用MPT83RNA疫苗免疫小鼠，接种完成后，第24h就已经在细胞内观察不到MPT83RNA，这表明 RNA疫苗编码的MPT83抗原在小鼠体内只能进行极其短暂的瞬时表达 。

通过肌肉注射MPT83DNA疫苗或者MPT83RNA，免疫小鼠，在特定时间点，收集肌肉细胞，提取细胞内Total RNA，通过RT-PCR测定细胞内MPT83 mRNA水平。 比较MPT83DNA疫苗和RNA疫苗触发的免疫反应

MPT83DNA疫苗( CMV4.83 )或者RNA疫苗( Sin.83 )免疫小鼠，接种剂量是50ug DNA疫苗或者RNA疫苗，通过肌肉注射的方式，接种4次，每次间隔3周。同时，设置对照组，包括空白质粒载体DNA( CMV4 )，RNA对照（ SinGFP ）BCG疫苗。

在完成DNA或者RNA疫苗接种4周以后，与对照组相比，接种MPT83DNA疫苗或者RNA疫苗触发的 血清抗体水平 ，源自脾脏的T细胞经过MPT83抗原蛋白诱导分泌的 IFN-γ干扰素水平 ， 体内CD8 + 细胞溶解 被MPT83抗原蛋白感染细胞的能力，均发生非常显著的提升，这表明 接种MPT83DNA疫苗或者RNA疫苗均可触发非常显著的体液免疫和细胞免疫。

接种MPT83DNA疫苗或者RNA疫苗均可触发非常显著的体液免疫和细胞免疫

在完成DNA或者RNA疫苗接种4周以后，用M.tuberculosis H37Rv毒株尾静脉感染，感染剂量是5×105 CFU。感染6周以后，检测肺部H37Rv毒株载量，发现接种MPT83DNA疫苗或者 RNA疫苗的小鼠肺部毒株载量同对照组相比有一个较为明显的下降 ，说明两者疫苗都可以机体提供一个中度程度的保护力。但是，在接种疫苗完成6个月以后，感染毒株时，只有MPT83 DNA疫苗才能提供非常有效的保护力，所以，MPT83 RNA疫苗只能在接种疫苗完成后短期内提供比较有效的保护效果。

需要注意的是， 与BCG诱导小鼠产生的强烈保护力相比， MPT83 RNA疫苗存在明显的缺陷，而且只能提供短期的保护效果 ，但是这项研究的数据第一次证实用RNA疫苗确实能够触发机体产生明显的体液免疫和细胞免疫。

接种MPT83DNA疫苗或者RNA疫苗完成后，第6周或者第6个月，用H37Rv毒株感染小鼠，检测小鼠肺部的细菌载量。 TB mRNA疫苗模拟设计

免疫信息学 作为生物信息学的分支，通过计算分析免疫数据，利用计算模型进行疫苗模拟设计。免疫信息学预测强有力的抗原以及抗原表位，缩减疫苗研发的成本，加快研发速度。

H. Al Tbeishat 在 Scientific Reports 发表文章 Novel In Silico mRNA vaccine design exploiting proteins of M. tuberculosis that modulates host immune responses by inducing epigenetic modifications ， 使用免疫信息学的手段 ， 预测 能够影响宿主表观遗传修饰的结核分枝杆菌抗原蛋白极其表位，并且利用多种计算模型工具对于其优化， 模拟构建TB mRNA疫苗 。

mRNA疫苗体外生产和胞内作用机制 结核分枝杆菌表观遗传调控蛋白

病原菌的代谢产物可以在不改变宿主DNA序列的情况下，影响宿主细胞基因的表达，此过程称为表观遗传修饰，主要包括RNA修饰，组蛋白调控，染色体塑形，DNA甲基化，DNA甲基化等。 结核分枝杆菌表观遗传修饰调控因子可以影响宿主天然免疫系统和适应性免疫系统基因的表达水平 ，在结核分枝杆菌感染宿主的过程中发挥着非常重要的作用。

TB疫苗模拟表位筛选和序列结构优化

首先，研究人员筛选出9个与结核分枝杆菌对宿主细胞进行表观遗传修饰相关的重要蛋白。接着，用相关的免疫学预测网站，依次对对这些蛋白的 B细胞表位 ， 辅助性T细胞表位 ， 杀伤性T细胞表位 进行 预测 。还需要对筛选出来的 T细胞表位和MHC分子做分子对接 （ molecular Docking ），从中找到最优的候选表位，最后将这些表位拼接起来构建mRNA序列。最后，需要用一系列的相关网站，对设计好的mRNA疫苗，进行 免疫原性，毒性，理化性质，过敏性 进行评估。此外，研发人员还对mRNA疫苗序列进行 密码子优化 ， 二级结构预测 ， 编码抗原肽的结构预测，B细胞表位构象预测 等一系列计算机模拟工作。

将筛选到的抗原表位拼接在一起构建mRNA疫苗

TB mRNA疫苗序列优化以及结构预测 模拟免疫反应

研究人员 模拟疫苗免疫反应 ，注射3次疫苗，结果发现，第2针和第3针引发的免疫反应远高于初次免疫，产生的IgM抗体高于IgG抗体；在抗原减少以后，免疫球蛋白的水平还可以维持在一个较高的水平。由于B细胞表位的存在，触发B细胞完成类别转换，产生免疫记忆B细胞。而且，CTL和HTC细胞数量也发生了增加，产生免疫记忆T细胞。此外，还对巨噬细胞活性，DC细胞活性，分泌的细胞因子进行模拟反应和评估。

使用C-ImmSim server对TB mRNA疫苗进行模拟免疫刺激反应 模拟设计网站

本研究从抗原表位筛选到序列设计优化，再到疫苗免疫效果以及安全性评估，全部是通过相关的网站来模拟进行，对本研究所设计到的网站，进行归纳总结，在今后的疫苗研发中，我们也可以尝试使用这些网站进行预测优化。

免疫信息学相关的模拟预测网站 自复制型TB RNA疫苗

在 2022年 ， Rhea N. Coler 在 BioRxiv 上传文章： RNA-based vaccine demonstrates prophylactic efficacy against Mycobacterium tuberculosis challenge in a mouse model ， 首次在小鼠模型中评估TB repRNA疫苗的有效性。 研发人员用自复制reRNA平台 编码一种临床前的结核疫苗候选抗原ID91 ，由4种结核分枝杆菌蛋白构成，编码ID91的序列放置于甲病毒repRNA骨架中。用第一代非结构化脂质载体NLC（ nanostructured lipid carrier ）包封ID91 repRNA。

ID91 repRNA疫苗序列设计

比较ID91蛋白疫苗和repRNA疫苗在小鼠模型中的预防性免疫效果以及在接种一针疫苗6周以后的保护效果。他们发现单剂ID91+GLA-SE( 佐剂，提升T细胞反应 )蛋白疫苗（ 0.5ug ID91+5g GLA-SE/每剂 ）可以强烈激活分泌IFNγ, IL-2 , TNF 的CD4 + TH1细胞，不能激活产生细胞因子的CD8+细胞。相反， ID91 repRNA + NLC （ 1.0 ug/每剂 ） 疫苗 倾向于诱导产生更多的分泌IFNγ, IL-2 , TNF 的CD8 + 细胞，同时也能诱导产生中等程度的CD4 + TH1细胞 。与注射生理盐水的对照组相比，两种类型的疫苗均可 强烈诱导产生同等程度的ID91特异性的IgG抗体 。最后，当用低剂量的毒株Mtb H37Rv（50-100CFU）感染小鼠，三周以后测定小鼠肺部的细菌载量，发现两种类型的疫苗均可显著降低肺部的细菌载量。 以上数据表明，自复制型TB repRNA平台可以成功在小鼠模型中产生具有免疫原性的抗原，并且诱导产生抵御结核分枝杆菌感染的保护力。

单剂ID91 repRNA疫苗免疫小鼠，可以诱导产生中度程度的免疫反应，提供对毒株的预防性保护效果。 TB疫苗低效的原因

除了选择疫苗靶点的难度以及结核分枝杆菌自身强大的免疫逃脱能力 ，当前BCG疫苗和在研疫苗无法诱导产生有效控制感染的免疫反应，这并不是由于诱发的免疫反应太弱，而是由于诱发免疫反应的时间太慢。小鼠初次感染结核菌14-21天后，肺部才能积累大量的活化CD4 + T细胞。由于早期APC递呈抗原的过程受到结核菌的抑制，活化的CD4 + T细胞在肺部的积聚有严重的滞后现象。即便小鼠体内已经存在疫苗诱导产生的CD4 + T记忆细胞免疫细胞的激活延迟，CD4 + T记忆细胞也得发生感染以后12-14天才能到达肺部。免疫细胞活化的严重滞后，使得结核菌能够在体内大量繁殖。

在 2016 ， Shabaana A Khader 在 Nature Communications 发文章 T argeting dendritic cells to accelerate T-cell activation overcomes a bottleneck in tuberculosis vaccine efficacy ，发现如果接种BCG疫苗的小鼠在遭受结核菌侵染时，同时给小鼠肺部输送外源已经激活DC细胞，那么将会克服记忆CD4+T细胞的活化滞后，可以使得肺部几乎检测不到细菌载量。 这项研究是一个概念证明，表明免疫反应快速启动的时间，而不是免疫反应的强度决定结核疫苗的有效性 。问题在于，研究人员用来加速免疫反应的技术——在感染结核病时给予额外的免疫细胞——无法在现实生活中复制，因为无法知道人们何时会接触到细菌。

世界各地使用的结核疫苗—卡介苗，只能将结核分枝杆菌的感染机率降低20%，而一种真正有效的预防性疫苗，可以将感染的几率降低95%，甚至更多。几十年以来，科学家坚持不懈地研发更加有效的预防结核病的疫苗，但是这些努力只是积累了许多经验，至今未有新型结核疫苗研发成功。希望，mRNA技术能够克服结核疫苗研发过程中的诸多难点，凭借快速的疫苗研发进度，可以在不久的将来开发出高效的mRNA结核疫苗，真正终结纠缠人类数千年的幽灵。

1.The global burden of latent tuberculosis infection: a Re-estimation using mathematical modelling

2.Global Tuberculosis Report 2021.

3.Drug Discovery Targeting Drug-Resistant Bacteria.

4.题图出自Google图库

2022年4月27日（星期三）19：30--21:00 ， 厚泽生 物联合诺唯赞 ，生物制品圈， 将主要围绕加帽率检测，加尾长度检测前处理过程和结果分析中的常见问题，及毛细管电泳检测mRNA质量完整性指标、常见的毛细管分析图谱、mRNA保存过程中质量变化，探索mRNA制备过程中质量控制思路，获得更佳的mRNA制备方法 展开精彩分享。

2022年4月27日(周三)

19:30-21:00

主题一 ： mRNA质量分析-加帽率及加尾长度分布检测

直播内容 ：