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我们在这里描述了一个简单的方法，表达，提取和纯化重组人类IgG融合到GGFP 在尼科蒂亚娜本thamiana。 该协议可以扩展到使用柱色谱的众多蛋白质的纯化和可视化。此外，该协议还适用于本学院教学实验室的亲上和虚拟教学实验室，提供基于项目的探索。

这是一个简单的方法的表达，提取和纯化重组人类IgG融合到GP在烟草相关的尼科蒂亚娜本thamiana植物。该协议可用于纯化和可视化植物产生的抗体、抗体融合和大多数蛋白质，这些蛋白质可以通过柱色谱进行纯化。该协议允许大学工作实验室的研究人员和学生可视化GP标记蛋白质在蛋白质生产过程的最步骤。

将土壤泥炭颗粒放在托盘上，将以前煮熟的、仍然热水的热水倒在泥炭颗粒上，进行完全膨胀。颗粒需要几分钟才能完全展开。托盘完全膨胀后，使用钳子在每个泥炭颗粒上放置两到三个尼科蒂亚娜本thamiana 种子。

完成此工作后，您需要倒入约 0.5 英寸的水以覆盖托盘的底部。不要忘记将托盘与播种日期标记。继续每天用适当数量的肥料给幼苗浇水。

托盘应覆盖一个湿润的上衣，并放在一个生长室。种子泥炭颗粒应保存在23至25摄氏度的生长室，照片周期为16小时，相对湿度为60%。一周后，从颗粒中去除额外的植物，让每个泥炭托盘只剩下一个幼苗。

当植物有两到三周大时，将每个泥炭颗粒转移到一个含有水分控制的土壤的单独锅中。继续每天用每升一克肥料给幼苗浇水，绝不让土壤完全干燥。植物在五到六周大时已经做好了渗透的准备。

必须在 Bunsen 燃烧器旁边执行以下步骤，并且应应用基本的无菌技术以避免污染。您将需要一个 Lb 卡纳霉素板。每毫升卡纳霉素浓度1微克。

严格与两个突变EHA105窝藏你期望的卡那霉素抗性结构，并在一夜之间生长。EHA105是两种突变中最常用的菌株之一。为了开始培养，用10毫升的磅介质填充锥形管，接下来，在10微升，每毫升卡纳霉素100微克，您还可以添加10微升2.5微克每毫升利福霉素，以防止大肠杆菌污染。

从盘子里，您将使用 PCR 验证的单一孤立殖民地来发展您的新文化。选择你孤立的殖民地，并接种到磅。将接种放在摇床上。

在30摄氏度和120至150 RPM过夜孵育。第二天，如果将农业细菌培养被吸引到等于0.6至0.9的OD600，则可用于渗透。如果过度生长的OD600高于一到两毫升，应转移到一个新鲜的磅抗生素，并成长为所需的OD600。

一旦在适当的OD600将培养物放在离心机中，确保离心机是平衡的。在室温下以4，500G离心，将细菌中离心20分钟。他们不能从两个样本中超生。

然后重新暂停每个颗粒和一个 X 渗透缓冲液，使最终的 OD 为 0.4。将每个IgG融合构造的相等体积与光链构造相结合，获得每个管中每个构造0.2的最终OD。采取回形针和五到六周大和半面植物从第一步。

使用回形针的锋利边缘展开，在叶子的第一个表皮层中形成一个小穿刺。避免一直刺穿叶子。填充一毫升注射器，无需用第二步准备的农业细菌溶液连接针头。

用注射器的端盖上一步中孔。然后慢慢推动将细菌注入叶子，同时从叶子后面施加温和的反压。尝试渗透大部分叶和戳叶最多三到四次，过量的叶子损害可能会阻碍蛋白质的产生。

在注射溶液时，注意叶变暗，而不会对注射器施加太大的压力。从底部的视图中，渗透的植物叶将大多显示为深色。请注意，这种细菌溶液应该足够至少三到四个植物每个构造。

在丢弃之前，请先将任何剩余的细菌溶液中解。完成无针渗透后，将植物放回生长室，继续每天浇水。观察叶的叶为氯化，坏死以及GP荧光，冬季长和短波紫外线灯。

通常第四天和第五天离开，显示最高的GP荧光。在渗透后四到五天收获所有叶子，并权衡叶料总量。您可以立即将叶料用于下游加工，也可以在负 80 摄氏度中冷冻，直到它准备好将渗透的植物放回生长室，每天继续浇水。

观察渗透区叶叶、坏死、颜色变化和叶组织死亡。GFP 荧光的观察植物。如果 GFP 存在于长波和短波紫外灯下。

蛋白质表达随时间而增加，两个GP构造的最高荧光通常发生在第4天和5天之间。在渗透后四到五天收获所有叶子，并称量总叶料。立即用于下游工艺，或在负 80 摄氏度下冻结，直到准备好使用。

在混合过程中，请确保在使用前将缓冲液和搅拌杯放在冰上或摄氏四度。将植物组织从第四步放入审前搅拌杯中。在冷却萃取缓冲液中，含有相应的PMSF和抗酸钠浓度，以搅拌杯。

将搅拌杯放在搅拌机上，拿一张预切的半膜，然后伸展到搅拌杯的顶部。将叶组织与萃取缓冲液混合，以第 22 个间隔想象 80。您需要根据需要在混合循环之间搅拌良好。

混合物应看起来同质，没有叶料块。将混合材料转移到烧杯上。在搅拌棒上搅拌4摄氏度30分钟，以提高蛋白质溶解性，并允许固体沉淀。

将两层裸布放在干净的烧杯上，然后倒入碎屑中，清除大叶碎屑。毕竟提取物通过镜布倒入后折叠镜布以挤压残留的叶提取物。提取物应显示为深绿色，没有可见的颗粒物。

将萃取器转移到离心管。在摄氏4度下，将萃取器在16，000G下离心20分钟。这将颗粒任何剩余的不溶性材料。

确保两个管子均平衡，并且转子盖牢固拧紧。离心后，颗粒应该是可见的，说是上一液，并丢弃颗粒。使用 50 毫升注射器和玻璃纤维过滤器过滤上清液。

收集 50 微升样品并标记粗提取物，供以后分析。设置一个包含 20 毫升样品的聚丙烯柱。根据目标免疫球蛋白类型及其与树脂的亲和力估计所需的浆量。

在此演示中，我们使用三毫升的泥浆。一般三毫升总浆料与1.5毫升床体积是有效的纯化几毫克抗体。小心地将所需数量的重新泵入盖柱中。

从柱底部打开柱出口，并允许其排出，直到大部分缓冲区消失。立即将 10 毫升洗涤缓冲液倒在顶部 1 次 PBS。让它排干，重复这个洗涤步骤两次。

将筛选的样本从步骤 5 应用到列并收集流式处理。50 微升的流量为等量，供以后分析。保存其余的流经，以防抗体没有结合到树脂中。

用 10 毫升 1 倍 PBS 洗涤树脂两次，以减少非特异性结合。如果需要，当缓冲液通过柱排出时，等同 50 微升的洗涤液将排出，以验证目标抗体是否与洗涤缓冲液有关。当洗涤缓冲液通过树脂运行时，设置并标记五个微离心管，其中125微升无菌，一个摩尔三叶-HCL在pH 8用于中和洗脱缓冲液。

或者，添加两个摩尔三叶基的 30 微升，以获得更浓缩的水杨酸盐。在洗脱过程中，UV 光可用于可视化。在洗脱期间不需要这样做。

如果您正在使用紫外线，请务必穿戴适当的个人防护设备，以避免对眼睛和皮肤造成伤害。在洗脱步骤期间不需要使用紫外线。通过将五毫升洗脱缓冲液涂抹到柱上，并收集一毫升分数，从上一步的每个指定管中，对抗体进行洗脱。

立即通过应用 20 毫升，然后应用 10 毫升洗涤缓冲液重新生成柱。确保树脂长时间不留在酸性环境中。洗脱应出现荧光。

通常，最高荧光出现在第二洗脱中，但可能因提取而异。对于储存，用10毫升20%乙醇和PBS清洗树脂，让半排空。回顾一下柱子的顶部，然后回顾柱子的底部，并保持在四摄氏度的直立。

将每分的 80 摄氏度和 50 微升的 Eluates 储存到单独的管中，以进行进一步分析。一般来说，蛋白质的持续时间可以重复使用多达10次，而不会造成重大的效率损失。有关确定抗体浓度的具体细节，请参阅制造商指南，使用分光光度计测量 280 纳米的吸光度。

将每分的 Eluates 储存在零下 80 摄氏度和每馏分的 50 微升中，放入单独的管中，以作进一步分析。Zs页面对纯化蛋白质的分析可以通过遵循标准协议进行。观察到荧光的结果表明克隆、渗透和表达含有GP的构造是成功的。

在几天内，荧光在4天和5天随着高荧光而逐渐增加。当蛋白质G使用荧光蛋白结合，随后从列洗脱表明纯化IgG融合包含作为一个稳定的GP。和紫外线暴露凝胶，你可以看到只有25KDa和75KDa带的梯子。

您还可以看到，非减少洗脱2样本。非减小洗脱保持其荧光作为相对大小，人们期望从一个完整的IgG作为其稳定的GP融合。在库马西染色凝胶中，同时对减少和非减少的样品进行可视化。

所有梯形成分都是可见的，原生蛋白质和IgG融合可以在总提取上清液和流经样品中看到。洗涤包含少量的IgG融合。洗脱一和四含有较少浓度的蛋白质，因为大多数蛋白质通常从第二和第三洗脱步骤中脱去。

洗脱 2 非还原也可以看到多个波段存在于所有减少洗脱样品中。75KDa 表示 GFP 的链条保险丝。50KDa 表示仅重链，25KDa 表示仅轻链，10 KDA 可能表示降解，通过添加蛋白酶抑制剂可以预防。

该协议可用于纯化任何抗体融合到任何所需的靶蛋白。该过程可以编辑，以适应不同数量的叶材料，也允许蛋白质的存在之前，期间和之后，蛋白质提取和纯化过程的结论的视觉测定。这些方法可以作为控件使用，并且可用于教学技术。

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