李硕, 倪向敏, 徐喆, 朱文艺, 梁馨予, 王建. 雌马酚通过PI3K/AKT通路对高糖高脂环境下成骨细胞凋亡及增殖的影响[J]. 陆军军医大学学报, 2023, 45(4): 349-357.   DOI: 10.16016/j.2097-0927.202207184 LI Shuo, NI Xiangmin, XU Zhe, ZHU Wenyi, LIANG Xinyu, WANG Jian. Effects of equol on apoptosis and proliferation of osteoblast through PI3K/AKT pathway in high glucose and high fat environment[J]. Journal of Army Medical University , 2023, 45(4): 349-357.   DOI: 10.16016/j.2097-0927.202207184 这篇开放获取文章遵循CC BY许可协议 [ 摘要 ] 目的 探讨雌马酚(equol，Eq)对高糖高脂环境下成骨细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制。 方法 建立ROS17/2.8成骨细胞高糖高脂损伤模型，设立对照组(C组)、模型组(M组)、不同浓度梯度Eq干预组(Eq ^-7 组：1×10 ^-7 mol/L Eq，Eq ^-6 组：1×10 ^-6 mol/L Eq，Eq ^-5 组：1×10 ^-5 mol/L Eq)。药物处理24 h后，采用CCK-8、HE染色检测成骨细胞活性及形态结构变化，流式细胞术检测细胞凋亡及周期改变，Western blot检测细胞PI3K/AKT通路磷酸化程度及相关蛋白表达变化，并联合PI3K抑制剂验证PI3K/AKT通路在其中的作用。 结果 与C组比较，M组成骨细胞存活率降低、细胞抑制率增加( P < 0.05)，细胞形态结构明显损伤，细胞凋亡率增加( P < 0.05)，细胞周期G ₁ 期比例增加、S期比例降低( P < 0.05)，PI3K/AKT通路磷酸化程度降低、Cyclin D1、Bcl-2表达减少、Bax、cleaved caspase-3表达增加( P < 0.05)；与M组相比，各Eq干预组细胞存活率增加、细胞抑制率降低( P < 0.05)，细胞形态结构损伤减轻，细胞凋亡减少( P < 0.05)，细胞周期G ₁ 期比例降低、S期比例增加( P < 0.05)，PI3K/AKT通路磷酸化程度提高、Cyclin D1、Bcl-2表达增加、Bax、cleaved caspase-3表达减少( P < 0.05)，且Eq的干预效应随着浓度升高而增强；联合PI3K抑制剂后，Eq的上述效应显著降低。 结论 Eq可通过激活PI3K/AKT通路减少高糖高脂环境下成骨细胞凋亡、促进成骨细胞增殖。 Effects of equol on apoptosis and proliferation of osteoblast through PI3K/AKT pathway in high glucose and high fat environment [ Abstract ] Objective To explore the effect and mechanism of equol(Eq) on the proliferation and apoptosis of osteoblasts in high-glucose and high-fat environment. Methods High-glucose and high-fat model of ROS17/2.8 osteoblasts was established, and cells were divided into the control group (C group) and the model group (M group), the Eq ^-7 group (1×10 ^-7 mol/L Eq), the Eq ^-6 group(1×10 ^-6 mol/L Eq) and the Eq ^-5 group(10 ^-5 mol/L Eq). CCK-8 assay and HE staining was used to detect the viability and morphology of osteoblasts; Flow cytometry was used to test the apoptosis and cell cycle; Western blotting was used to detect the phosphorylation of PI3K/AKT signaling pathway and expression of associated proteins of osteoblasts. PI3K inhibitor was added to confirm the role of PI3K/AKT signaling pathway in the osteoprotective effect of Eq. Results Compared with the C group, the cell structure of the M group was significantly damaged, the cell survival rate, proportion of S phase of cell cycle, the degree of phosphorylation of PI3K/AKT pathway, the expression of Cyclin D1 and Bcl-2 in the M group decreased, while cell inhibition rate, cell apoptosis, proportion of G ₁ phase of cell cycle, the expression of Bax and cleaved caspase-3 of the M group increased ( P < 0.05); Compared with the M group, the Eq groups had increased cell survival rate, decreased cell inhibition rate, enhanced fraction of osteoblast in the S phase and decreased osteoblast apoptosis rate( P < 0.05). Eq treatment enhanced the phosphorylation of PI3K/AKT pathway of osteoblasts and increased expression level of Cyclin D1 and Bcl-2 protein and decreased expression of Bax and cleaved caspase-3 ( P < 0.05). The intervention effect of Eq enhanced with the increase of concentration of Eq. However, this regulatory effect of Eq almost disappeared after co-administration of PI3K inhibitor. Conclusion Eq can reduce the apoptosis and promote the proliferation of osteoblasts in the high-glucose and high-fat environment by activating the PI3K/AKT pathway.

大豆异黄酮属于植物雌激素，可发挥抗动脉粥样硬化、改善胰岛素分泌障碍、抑制癌症发生、抗骨质疏松症等多种生物学效应 ^{[ 2 ]} 。雌马酚(equol，Eq)是大豆异黄酮在体内代谢的终产物之一，其生物学效应较大豆异黄酮更强。课题组前期研究发现Eq可促进成骨细胞增殖，改善患者绝经后骨质疏松症 ^{[ 3 - 4 ]} 。绝经后骨质疏松症以雌激素缺乏为主要发病机制，而DOP的发病涉及糖脂代谢毒性、细胞因子水平变化、氧化应激、炎症反应、糖尿病并发症等多种因素，其发病机制相较于绝经后骨质疏松症更为复杂 ^{[ 5 ]} 。迄今为止关于Eq对DOP的疗效及机制鲜有报道。本研究开展体外实验探讨Eq在高糖高脂环境下对成骨细胞增殖和凋亡的影响及机制，为DOP的预防和治疗提供新的实验依据。

1 材料与方法 1.1 材料

本研究主要使用的材料：ROS17/2.8成骨细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)，S-雌马酚(上海大赛璐药物手性技术有限公司)，高糖高脂试剂盒(西安鲲创科技发展有限公司)，细胞周期与凋亡检测试剂盒(上海碧云天公司)、Annexin V-EGFP/PI细胞凋亡检测试剂盒(武汉赛维尔公司)，磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyl inositol 3 kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)及磷酸化PI3K、AKT多克隆抗体(p-PI3K，p-AKT)(美国Proteintech公司)，细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl2-Associated X，Bax)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3)多克隆抗体(上海Abmart公司)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)单克隆抗体(上海碧云天公司)，LY294002(PI3K抑制剂，上海碧云天公司)。

1.2 方法 1.2.1 细胞培养

ROS17/2.8细胞在DMEM培养基(10%胎牛血清，1%青-链霉素)中培养。在细胞密度达80%后，胰酶消化细胞然后离心、重悬、传代。在培养箱内(37 ℃，5% CO ₂ )传至第3代后收集对数期细胞进行后续实验。

1.2.2 细胞分组及干预

采用25 mmol/L葡萄糖+250 μmol/L棕榈酸钠模拟T2DM机体成骨细胞高糖高脂细胞微环境，S-Eq粉剂溶于DMSO溶剂配制不同浓度梯度Eq母液。实验分组依次为对照组(C组，5.5 mmol/L葡萄糖)、模型组(M组，25mmol/L葡萄糖+250 μmol/L棕榈酸钠)、Eq ^-7 组(25 mmol/L葡萄糖+250 μmol/L棕榈酸钠，1×10 ^-7 mol/L Eq)、Eq ^-6 组(25 mmol/L葡萄糖+250 μmol/L棕榈酸钠，1×10 ^-6 mol/L Eq)、Eq ^-5 组(25 mmol/L葡萄糖+250 μmol/L棕榈酸钠，1×10 ^-5 mol/L Eq)，药物干预24 h后进行后续检测。

A：CCK-8检测高糖高脂环境下不同浓度Eq干预对ROS17/2.8细胞存活率的影响；B：CCK-8检测高糖高脂环境下不同浓度Eq干预对ROS17/2.8细胞抑制率的影响a： P < 0.001，与C组比较；b： P < 0.001，与M组比较；C：HE染色检测高糖高脂环境下不同浓度Eq干预对ROS17/2.8细胞形态的影响(×200) Eq改善高糖高脂环境下ROS17/2.8细胞活性及形态结构( n =6， x ± s ) A：流式细胞术检测高糖高脂环境下不同浓度Eq干预对ROS17/2.8细胞凋亡的影响；B: 高糖高脂环境下不同浓度Eq干预后ROS17/2.8细胞凋亡比例；C：流式细胞术检测高糖高脂环境下不同浓度Eq干预对ROS17/2.8细胞周期的影响; D: 高糖高脂环境下不同浓度Eq干预后ROS17/2.8细胞各周期比例a： P < 0.001，b： P < 0.01，与C组比较；c： P < 0.001，与M组比较 Eq对高糖高脂环境下ROS17/2.8细胞凋亡及周期的影响( n =3， x ± s ) A：Western blot检测高糖高脂环境下不同浓度Eq干预对ROS17/2.8细胞蛋白表达的影响；B~G：Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、Cyclin D1、p-PI3K、p-AKT的蛋白相对表达量；1：C组；2：M组；3：Eq ^-7 组；4：Eq ^-6 组；5：Eq ^-5 组；a： P < 0.001，b： P < 0.05，与C组比较；c： P < 0.001，d： P < 0.01，与M组比较 Eq对高糖高脂环境下ROS17/2.8细胞相关蛋白表达的影响( n =3， x ± s ) A：CCK-8检测高糖高脂环境下Eq联合LY294002干预对ROS17/2.8细胞存活率的影响，B：CCK-8检测高糖高脂环境下Eq联合LY294002干预对ROS17/2.8细胞抑制率的影响1：C组；2：M组；3：Eq组；4：Eq+LY294002组；5：M+LY294002组；a： P < 0.001，与C组比较；b： P < 0.001，与M组比较；c： P < 0.001，与Eq组比较 联合LY294002后Eq对高糖高脂环境下ROS17/2.8细胞活性的影响( n =6， x ± s ) A：高糖高脂环境下Eq联合LY294002干预对ROS17/2.8细胞凋亡的影响；B：高糖高脂环境下Eq联合LY294002干预后ROS17/2.8细胞凋亡率；C：高糖高脂环境下Eq联合LY294002干预对ROS17/2.8细胞周期的影响；D: 高糖高脂环境下Eq联合LY294002干预后ROS17/2.8细胞各周期比例1：C组；2：M组；3：Eq组；4：Eq+LY294002组；5：M+LY294002组；a： P < 0.001，b： P < 0.01，与C组比；c： P < 0.001，与M组比较；d： P < 0.001，与Eq组比较 联合LY294002后Eq对高糖高脂环境下ROS17/2.8细胞凋亡和周期的影响( n =3， x ± s ) A：Western blot检测高糖高脂环境下Eq联合LY294002干预对ROS17/2.8细胞蛋白表达的影响；B~F：p-AKT、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、CyclinD1的蛋白相对表达量1：C组；2：M组；3：Eq组；4：Eq+LY294002组；5：M+LY294002组；a： P < 0.001，b： P < 0.01，与C组比较；c： P < 0.001，d： P < 0.01，e： P < 0.05，与M组比较；f： P < 0.001, 与Eq组比较 联合LY294002后Eq对高糖高脂环境下ROS17/2.8细胞相关蛋白表达的影响( n =3， x ± s ) 3.1 Eq对高糖高脂环境下成骨细胞的保护作用

糖脂代谢紊乱是T2DM患者最显著临床特征，主要表现为高糖高脂血症 ^{[ 9 ]} 。本研究采用葡萄糖联合棕榈酸钠模拟T2DM患者机体成骨细胞高糖高脂微环境 ^{[ 10 ]} 。CCK-8结果显示，在高糖高脂(25 mmol/L葡萄糖+250 umol/L棕榈酸钠)环境下成骨细胞存活率显著降低、细胞抑制率显著增加。结合HE染色发现，高脂高糖环境导致成骨细胞形态结构明显损伤，而在给予不同浓度梯度Eq干预后，可显著提高成骨细胞存活率、改善成骨细胞形态结构，且呈浓度梯度趋势。此外，流式细胞术检测结果显示高糖高脂环境下成骨细胞凋亡率增高，细胞周期G ₁ 期比例增加、S期比例降低。细胞周期主要由G ₁ /S期、G ₂ /M期、纺锤体装配3个检测点进行调节，细胞周期进展的关键在于G ₁ /S期的过渡 ^{[ 11 ]} 。高脂高糖环境下成骨细胞的细胞周期阻滞于G ₁ 期，提示成骨细胞的增殖分裂能力降低，而Eq干预不仅降低了成骨细胞凋亡率，还能加快G ₁ /S期进展，促进成骨细胞分裂增殖，且Eq的干预效应随浓度升高而增强。

3.2 PI3K/AKT通路与成骨细胞的增殖、凋亡

PI3K/AKT通路是调节骨骼生长发育的关键通路，在成骨细胞增殖、凋亡等生理过程中发挥重要作用。PI3K/AKT通路由PI3K、中间效应因子、AKT构成，在受体酪氨酸激酶激活后，PI3K将磷脂酰肌醇-二磷酸磷酸化，导致磷脂酰肌醇-三磷酸积累并激活AKT，调控下游Cyclin D1、胰岛素样生长因子1、Runt相关转录因子2、Bax、Bcl-2等多种蛋白表达，进而调节成骨细胞的增殖、分化和凋亡过程 ^{[ 12 ]} 。而T2DM可降低成骨细胞PI3K和AKT的磷酸化程度、抑制PI3K/AKT通路效应，是DOP发生发展的重要促进因素 ^{[ 13 ]} 。Cyclin D1是调控细胞周期G ₁ 期的关键蛋白，能够推动细胞周期由G ₁ 期向S期转换，在整个细胞周期进展及细胞增殖中发挥关键作用。文献[ 14 ]指出，在PI3K/AKT通路受抑制后，GSK-3β等磷酸化程度升高，Cyclin D1蛋白经泛素蛋白酶体降解增多，细胞增殖分裂受抑制。Bcl-2基因家族属于原癌基因家族，在调控线粒体途径介导的细胞凋亡中发挥重要作用，该基因家族表达的Bcl-2属于抗凋亡蛋白，可通过蛋白的跨膜锚定区锚定于线粒体外膜，抑制线粒体细胞色素C的释放及caspase-3的活化，减少线粒体介导的细胞凋亡。Bax功能与Bcl-2相反，是Bcl-2家族最重要的促凋亡因子，可与Bcl-2构成异源二聚体，改变线粒体膜通透性、激活caspase-3，导致细胞凋亡增加。相关研究发现PI3K/AKT通路抑制可导致成骨细胞Bcl-2/Bax比例降低，cleaved caspase-3表达增多，导致细胞凋亡 ^{[ 15 ]} 。

3.3 Eq激活PI3K/AKT通路、调控下游靶蛋白表达

Western blot结果显示，高糖高脂环境下成骨细胞PI3K及AKT磷酸化程度显著降低，与王昆 ^{[ 16 ]} 研究结果一致。另外本次研究发现，高糖高脂环境下成骨细胞Cyclin D1、Bcl-2表达显著降低、Bax和cleaved caspase-3表达显著升高，而Eq干预能够激活PI3K/AKT通路、提高Cyclin D1、Bcl-2表达水平、下调Bax、cleaved caspase-3表达水平，减轻高糖高脂诱发的成骨细胞凋亡、推动细胞周期进展，并且随着Eq浓度升高，其干预效应增强。综合上述结果，本研究推测Eq可能通过调节PI3K/AKT通路进而调控Cyclin D1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3等下游分子表达，发挥成骨细胞保护效应。为进一步验证PI3K/AKT通路的作用，本研究联合应用PI3K抑制剂，结果显示在联合应用PI3K抑制剂后，Eq抑制高脂高糖环境下成骨细胞凋亡、促进细胞增殖的效应显著降低，对Cyclin D1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3等蛋白的调控能力显著减弱，提示Eq主要通过PI3K/AKT通路对高糖高脂环境下成骨细胞发挥保护效应。另外，在应用LY294002后，本研究发现M+LY294002组ROS17/2.8细胞的细胞活性、细胞凋亡和周期、细胞蛋白表达等指标虽然略高于或低于M组，但两组各指标尚无统计学差异，分析原因可能如下：①根据2.3结果，ROS17/2.8细胞的PI3K/AKT通路在高糖高脂环境下已被显著抑制，在此情况下联合应用LY294002效应不显著，因而未出现叠加效应；②根据2.1结果，高糖高脂环境下ROS17/2.8细胞形态显著改变、活性极大降低，导致细胞对LY294002反应不明显、LY294002效应不显著。

SI Y H, WANG C Y, GUO Y, et al . Prevalence of oste oporosis in patients with type 2 diabetes mellitus in the Chinese mainland: a systematic review and meta-analysis[J]. Iran J Public Health, 2019, 48(7): 1203-1214. 李硕, 王建. 大豆异黄酮临床应用的研究进展[J]. 大豆科学, 2020, 39(4): 633-640.
LI S, WANG J. Research progress on the clinical application of soybean isoflavones[J]. Soybean Sci, 2020, 39(4): 633-640. WANG J, XU J, WANG B, et al . Equol promotes rat osteoblast proliferation and differentiation through activating estrogen receptor[J]. Genet Mol Res, 2014, 13(3): 5055-5063. 吴彬, 张勇, 陈明亮, 等. 雌马酚对去卵巢后大鼠骨质疏松症的影响[J]. 第三军医大学学报, 2015, 37(3): 256-260.
WU B, ZHANG Y, CHEN M L, et al . Equol improves osteoporosis in ovarietomized rats[J]. J Third Mil Med Univ, 2015, 37(3): 256-260. 王盼, 吴科锋, 崔燎. 不同阶段2型糖尿病诱发骨质疏松症的致病机制研究进展[J]. 中国骨质疏松杂志, 2020, 26(4): 619-624.
WANG P, WU K F, CUI L. Research progress on the pathogenesis type 2 diabetes-induced osteoporosis of different stages[J]. Chin J Osteoporos, 2020, 26(4): 619-624. MAGEE P J. Is equol production beneficial to health?[J]. Proc Nutr Soc, 2011, 70(1): 10-18. 任梓溢, 韦震, 姜宁, 等. 雌马酚对慢性睡眠干扰所致小鼠抑郁样行为的改善作用[J]. 大豆科学, 2022, 41(3): 323-329.
REN Z Y, WEI Z, JIANG N, et al . Protective effects of equol on depression-like behavior of mice induced by chronic sleep deprivation[J]. Soybean Sci, 2022, 41(3): 323-329. SEKIKAWA A, IHARA M, LOPEZ O, et al . Effect of S-equol and soy isoflavones on heart and brain[J]. Curr Cardiol Rev, 2019, 15(2): 114-135. 中华医学会内分泌学分会脂代谢学组. 中国2型糖尿病合并血脂异常防治专家共识(2017年修订版)[J]. 中华内分泌代谢杂志, 2017(11): 925-936.
Lipid Metabolism Group of Chinese Society of Endocrinology. Expert consensus on prevention and treatment of type 2 diabetes complicated with dyslipidemia in China (revised edition 2017)[J]. Chin J Endocrinol Metab, 2017(11): 925-936. 吴娟, 邱绮虹, 杨骥锋, 等. 高糖高脂抑制成骨细胞增殖及促进凋亡[J]. 中华老年口腔医学杂志, 2018, 16(2): 65-70.
WU J, QIU Q H, YANG J F, et al . High glucose and free fatty acid inhibit proliferation and induce apoptosis in osteoblast[J]. Chin J Geriatr Dent, 2018, 16(2): 65-70. 柯芷茵, 梁爱玲, 刘勇军. 细胞周期检测点激酶与肺癌耐药研究进展[J]. 中国肺癌杂志, 2021, 24(4): 265-270.
KE Z Y, LIANG A L, LIU Y J. Cell cycle checkpoint kinase and drug resistance of lung cancer[J]. Chin J Lung Cancer, 2021, 24(4): 265-270. 梁宁, 何斌, 张奇文, 等. 调控干细胞成骨分化的PI3K/Akt信号通路及相关因素[J]. 现代医学, 2022, 50(1): 126-130.
LIANG N, HE B, ZHANG Q W, et al . Stem cell development into osteoblasts is regulated by the PI3K/Akt signaling pathway and other factors[J]. Mod Med J, 2022, 50(1): 126-130. 张莹, 周艳红, 李江雁, 等. 基于PI3K/Akt通路研究利拉鲁肽对2型糖尿病骨质疏松大鼠的作用[J]. 中国骨质疏松杂志, 2021, 27(7): 985-989.
ZHANG Y, ZHOU Y H, LI J Y, et al . Effect of liraglutide on type 2 diabetic osteoporosis rats based on the study of PI3K/Akt pathway[J]. Chin J Osteoporos, 2021, 27(7): 985-989. 袁玥. SHP2通过PI3K/AKT/GSK3β信号通路调节Cyclin D1的稳定性来促进乳腺癌细胞的增殖[D]. 天津: 天津医科大学, 2020.
YUAN Y. SHP2 promotes proliferation of breast cancer cells through regulating cyclin D1 stability via the PI3K/AKT/GSK3β signaling pathway[D]. Tianjin: Tianjin Medical University, 2020. 张丰姣, 毛雨, 何丽, 等. 二甲双胍调控PI3K/Akt/mTOR通路减轻糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡[J]. 中国骨质疏松杂志, 2021, 27(9): 1323-1328.
ZHANG F J, MAO Y, HE L, et al . Metformin attenuates glucocorticoid-induced osteoblast apoptosis by regulating PI3K/Akt/mTOR pathway[J]. Chin J Osteoporos, 2021, 27(9): 1323-1328. 王昆. 柚皮苷通过抑制由PI3K-Akt-mTOR通路介导的自噬改善高糖/高脂应激造成的内皮细胞功能失常[D]. 南昌: 南昌大学, 2020.
WANG K. Naringin inhibits autophagy mediated by PI3K-Akt-mTOR pathway to ameliorate endothelial cell dysfunction induced by high glucose/high fat stress[D]. Nanchang: Nanchang University, 2020. LI Shuo, NI Xiangmin, XU Zhe, ZHU Wenyi, LIANG Xinyu, WANG Jian

雌马酚通过PI3K/AKT通路对高糖高脂环境下成骨细胞凋亡及增殖的影响

Effects of equol on apoptosis and proliferation of osteoblast through PI3K/AKT pathway in high glucose and high fat environment

陆军军医大学学报, 2023, 45(4): 349-357

Journal of Army Medical University, 2023, 45(4): 349-357

http://dx.doi.org/10.16016/j.2097-0927.202207184