1. 材料和方法

1.4. 动物模型的建立

动物术前适应性饲养 1 周，术前 12 h 禁水、禁食。用 3% 戊巴比妥钠静脉注射麻醉动物（施加剂量为：1 mL/kg），口腔插管，将动物仰卧于手术台，固定四肢，上下颌骨、颈部备皮，常规消毒和铺巾，术区局部注射体积分数为 2% 的利多卡因，在颏孔至下颌升支间，沿下颌骨下缘作一长约 2.5 cm 切口，钝性分离皮下组织，翻开骨膜，暴露术区骨面。于术区下颌骨颏孔后至下颌升支处用超声骨刀做一 2 cm × 1 cm × 1 cm 的骨缺损，如 图 1 所示，制造骨缺损时予以生理盐水冲洗降温。

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图 1

Establishment of animal model

动物模型的建立

对照组：下颌骨缺损区用对侧取下来的骨块充填，并用钛板钛钉固定；实验组：缺损处用去抗原猪松质骨充填，并用钛板钛钉固定；生理盐水冲洗，检查无明显出血点后分层缝合，留橡皮引流片 1 根，局部加压包扎。术后连续 3 天，每天 2 次肌注庆大霉素针 4 × 10 ⁴ U，以预防感染，术后第 2 天去除加压包扎，术后第 3 天去除引流条，并进软食 1 周，1 周后改普通饲料喂养，如 图 1 所示。

2. 结果

2.2. 影像学观察结果

术后 12 周，骨折断端固位良好、无移位，固位螺钉和钛板部分被少量新生骨组织覆盖。对照组及实验组均可见明显界限，新生骨组织的骨小梁不规则。术后 24 周，对照组的植入自体骨与周围骨边界基本消失，密度相近；实验组植入材料与周围骨部分融合，仍可见较明显边界，去抗原猪松质骨骨小梁部分可见，接近周围正常骨组织，如 图 2 所示。

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图 2

Imaging examination at week 24 postoperatively

术后 24 周影像学结果

术后 12 周，实验组异种骨 CBCT 的 CT 值和螺旋 CT 值均数低于对照组自体骨，差异具有统计学意义（ P < 0.05），且对照组自体骨、实验组异种骨两者 CBCT 的 CT 值均数低于正常松质骨及正常皮质骨，两者螺旋 CT 值均数低于正常皮质骨，差异具有统计学意义（ P < 0.05），提示自体骨、异种骨均在改建进行中。

术后 24 周，实验组异种骨 CBCT 的 CT 值均数低于对照组自体骨、正常松质骨及正常皮质骨，差异具有统计学意义（ P < 0.05），对照组自体骨与正常松质骨间没有统计学差异（ P > 0.05），提示异种骨的改建仍在进行中，密度较正常松质骨为低；而自体骨的改建已达到正常松质骨的水平。实验组异种骨螺旋 CT 值均数低于对照组自体骨、正常皮质骨，差异具有统计学意义（ P < 0.05），对照组自体骨块密度与正常下颌骨皮质骨相近，如 表 1 所示，表明异种骨的改建较自体骨为慢，而自体骨的改建在此时已基本达到正常皮质骨的水平。

表 1

CT value of postoperative CBCT、Spiral CT (n=4,

术后 CBCT、螺旋 CT 扫描 CT 值（n=4，

组别	术后 12 周			术后 24 周
	CBCT	螺旋 CT		CBCT	螺旋 CT
P <0.05，实验组 vs. 对照组、正常松质骨、正常皮质骨； # P <0.05，对照组 vs. 正常松质骨、正常皮质骨
对照组	853.57 ± 59.33 #	927.27 ± 39.64 #		1 131.00 ± 87.80	1 355.08 ± 102.35
实验组	688.47 ± 48.52 *	264.42 ± 24.66 *		1 040.58 ± 64.32 *	321.48 ± 17.84 *
正常松质骨	1 157.31 ± 89.94	–		1 164.17 ± 97.62	–
正常皮质骨	1 696.43 ± 113.72	1 387.54 ± 62.39		1 766.84 ± 138.96	1 415.88 ± 60.74

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SPECT 断层扫描结果显示：实验组与对照组缺损区均显示放射性增高，其中实验组一侧放射性增高程度较对照组为多。与 CT 断层扫描结果进行异机融合后，准确定位放射性增高部位即下颌骨缺损移植区。术后 12 周，实验组异种骨 ROI 的每立方厘米放射性浓度为 2 139.76 ± 132.63，对照组自体骨为 2 082.27 ± 116.46，差异无统计学意义（ P > 0.05），表明异种骨与自体骨均处于成骨活跃时期。术后 24 周，实验组异种骨 ROI 的每立方厘米放射性浓度为 1 988.91 ± 117.73，均数大于对照组自体骨 1 720.25 ± 98.24，差异具有统计学意义（ P < 0.05），表明异种骨的改建仍处于成骨活跃时期，成骨活性较高；自体骨的改建已基本完成，但仍存在一定的成骨活性，与 CBCT 检查结果一致。

3. 讨论

颌骨缺损的修复重建一直是口腔颌面外科方面的重点和热门课题，目前已有大量的骨移植材料用于研究并应用于骨缺损的修复重建手术，最常见的移植材料包括自体骨、异种骨、同种异体骨及人工骨材料等。其中，自体骨因携带部分自体的成骨细胞或骨髓干细胞、细胞因子以及生长因子，成骨效果明确，目前仍是治疗口腔颌面部骨缺损的“金标准” ^{[ 1 - 2 ]} 。但自体骨存在明显的缺点：来源有限，且会给患者带来额外的手术创伤，故不适用于修复大范围的骨缺损。同种异体骨来源虽较自体骨广泛，但存在着传播隐匿传染病、免疫排斥反应和伦理学等问题 ^{[ 4 - 5 ]} 。目前，大多数人工合成骨替代材料仍处于基础研究阶段，其生物相容性、力学性能、体内降解速度难以控制等仍是限制其广泛应用的瓶颈问题。而异种骨来源广泛，且制备过程中去除了细胞等抗原物质，虽不具有骨诱导性，但其天然的多孔微结构、合适的钙/磷比、优秀的力学性能和优异的骨传异性，可能比目前大多数合成材料更适合用于骨移植，成为了当前研究的热点 ^{[ 6 - 8 ]} 。因此，我们设计了本次实验，以“金标准”的自体骨为对照组，旨在探索以去抗原猪松质骨作为支架材料修复颌骨缺损的可能性，为临床修复大面积颌骨缺损提供新的选择。

骨组织能修复较小范围的缺损，当缺损范围较大时，则不能通过自愈能力来进行完全修复。有资料显示，犬下颌骨的非连续性缺损达 17 mm × 6 mm 时不能进行完全自我修复 ^{[ 9 ]} 。因此，本研究以犬作为实验对象，在两侧下颌骨制造 2 cm × 1 cm × 1 cm 的骨缺损以防止缺损自行愈合，同时避免产生病理性骨折；然后分别用自体骨、去抗原猪松质骨修复骨缺损，术后 24 周影像学检查可见缺损区均得到较好修复，成功建立了颌骨缺损修复的动物模型，可为今后相关研究提供参考。

本实验所用的去抗原猪松质骨既可作为单纯填充材料，也可以作为组织工程支架，复合加载种子细胞、细胞因子等。目前，限制异种骨得以广泛应用的最大障碍是移植后机体的免疫排斥反应。随着免疫学、生物化学等相关学科的发展，异种骨移植材料的制备工艺有了很大的进步，经过一系列的优化处理后，已基本去除了材料中的免疫原性成分，一定程度上能满足应用于临床的要求。本实验使用的去抗原猪松质骨经环氧交联固定，材料的抗原性被稳定地去除，毒性残留的问题也得到解决，并且能够最大程度地保留骨胶原的结构。另一方面，研究生物材料与机体适应性的最直接的手段仍是通过动物实验观察植入材料对机体造成的局部和全身反应。因此，建立动物模型验证材料在动物体内的安全性和生物相容性是研发新型材料的必要基础和重要步骤。在本实验中，所有实验犬均无死亡，未出现排斥反应，在后续的研究中，我们将对移植物提取液进一步作相关致敏实验。

理想的骨缺损修复支架材料应具有良好的力学性能、生物相容性、生物可降解性、三维立体高孔隙率等特性 ^{[ 10 ]} 。雷荣昌等 ^{[ 11 ]} 在对猪松质骨（髂骨）支架结构的研究中发现，猪松质骨支架孔径为（387.54 ± 21.60）μm，孔隙率为 78.26% ± 2.01%；最大抗压强度和抗压力分别为 25 MPa 和 12 N。可见猪松质骨保留了天然骨组织良好的力学性能和三维结构，可为成骨细胞的生长、分化以及生长因子的吸附提供良好的环境。因此，本实验采用猪髂骨为异种骨移植材料，经过脱脂、脱细胞处理，并采用环氧化物交联固定技术处理，从而保证材料有适宜的力学性能和优秀的生物相容性，然后用偶联剂将可黏附细胞和生长因子的特定多肽偶联到材料三维微孔的内表面。本材料虽并不具有骨诱导作用和成骨作用，但在制备过程中对其进行了表面修饰，改良了材料表面的微环境，因此把该材料植于体内可促进宿主间充质干细胞、成骨细胞等的增殖、分化及各类生长因子的黏附，从而在体内可逐步获得一定的骨诱导性能或成骨作用。

CBCT 是目前口腔影像最先进、应用最广泛的诊断手段之一，能准确地显示观察部位的三维空间结构，降低伪影的产生，避免周围结构重叠的影响 ^{[ 12 - 13 ]} 。同时，传统的 CT 检查密度分辨率高、定位准确。在本组实验中，螺旋 CT 与 CBCT 检查结果存在一定差别，可能与钛板钛钉的影响、两者原理不同及各自软件处理后所得到的 CT 值不同有关。但要注意的是，螺旋 CT 或 CBCT 常用于证实骨折以及骨折的愈合，只有当病变发展到“形态改变”时才被发现，因此并不能达到“早期诊断”的目的 ^{[ 14 ]} 。此外，当骨骼局部发生病变如骨折、肿瘤、炎症等时会引起局部血流量或（和）代谢改变， ^99m Tc-MDP 骨显像将于相应部位呈现放射性异常增高，因此，SPECT 骨显像的图像能获得骨移植部位各断层面的放射性浓度分布，提供其功能信息，达到监测愈合过程中成骨细胞活性的目的。但 SPECT 难以准确定位，不易得到精确的解剖结构和分辨骨移植区的边界。基于上述设备的优缺点，将多排螺旋 CT 与正电子发射计算机断层显像（positron emission tomography，PET）或 SPECT 两种先进的影像技术结合在一起进行图像融合可充分利用各自优点，同时得到功能代谢影像和解剖结构影像 ^{[ 14 - 17 ]} 。同机融合仪器 PET/CT 或 SPECT/CT 购置费用高，且国内多数医疗机构己置有 SPECT 或 CT，为充分利用现有资源，提高疾病的确诊率和病灶的定位精确度，我们觉得很有必要利用计算机软件将 SPECT 和 CT 进行异机图像融合，在不另外购置设备的条件下提高疾病的诊断水平。因此，本研究尝试应用 16 排螺旋 CT、SPECT 断层对骨移植区分别进行断层显像，然后再利用 SPECT 随机自带图像融合软件将两者图像进行融合，有机地实现了 CT 解剖成像和 SPECT 功能成像的精确融合，结果表明术后 24 周时异种骨仍处于成骨活跃时期，较自体骨成骨活性高，说明利用 SPECT/CT 融合显像能有效地监测成骨细胞的活动，判定骨移植的预后。虽然 SPECT/CT 融合显像作用明显，但并非所有骨显像患者都需要，因此，如何选择适应症是合理利用 SPECT/CT 的关键，也是我们需要进一步研究的内容。另外，图像异机融合与同机融合相比存在着一定的缺点，如缺少对 CT 图像的校正，影响图像的配准及融合的质量 ^{[ 18 ]} ，这要求我们尽量保持检查体位基本一致，并且需要对相关软件进行调试、研发。

综上所述，去抗原猪松质骨改建速度较自体骨为慢，但可作为支架材料修复颌骨缺损，为临床修复大面积颌骨缺损提供新的选择。要注意的是，到目前为止，去抗原方法较多，如冷冻干燥、高温煅烧、脱蛋白等，但仍未探索出如何在完全去除异种骨抗原的同时保留原有的力学性能 ^{[ 8 , 19 ]} 。如何优化制备工艺，同时获得异种松质骨最佳的力学性能和生物相容性，将是未来工作的研究重点。同时，利用异机融合技术可使医疗机构现有影像设备使用达到最优化。

Funding Statement

广东省医学科研基金资助项目（A2014384）；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（21615482）

References