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Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi.
2020 Oct 25; 37(5): 834–841.
Chinese.
doi:
10.7507/1001-5515.202003067
PMCID:
PMC10320536
PMID:
33140607
内脏脂肪素通过氧化低密度脂蛋白受体 1 介导血管内皮细胞炎症反应及坏死性凋亡的研究
Study on visfatin-induced inflammation and necroptosis via LOX-1 in human umbilical vein endothelial cells
晓宇 韩
成都市第二人民医院 老年医学科（成都 610017）, Geriatrics Department, Chengdu Second People’s Hospital, Chengdu 610017, P.R.China 四川大学华西医院 心血管疾病研究室（成都 610041）, Laboratory of Cardiovascular Diseases, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, P.R.China
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晓宇 韩
文超 吴
成都市第二人民医院 老年医学科（成都 610017）, Geriatrics Department, Chengdu Second People’s Hospital, Chengdu 610017, P.R.China
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文超 吴
小菁 刘
成都市第二人民医院 老年医学科（成都 610017）, Geriatrics Department, Chengdu Second People’s Hospital, Chengdu 610017, P.R.China 四川大学华西医院 心血管疾病研究室（成都 610041）, Laboratory of Cardiovascular Diseases, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, P.R.China
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小菁 刘
烨 祝
成都市第二人民医院 老年医学科（成都 610017）, Geriatrics Department, Chengdu Second People’s Hospital, Chengdu 610017, P.R.China 成都市第二人民医院 老年医学科（成都 610017）, Geriatrics Department, Chengdu Second People’s Hospital, Chengdu 610017, P.R.China 四川大学华西医院 心血管疾病研究室（成都 610041）, Laboratory of Cardiovascular Diseases, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, P.R.China 四川大学华西医院 心血管内科（成都 610041）, Vasculocardiology Department, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, P.R.China
烨 祝:
moc.361@4791eyuhz
祝烨，Email：
moc.361@4791eyuhz
Visfatin 是近年来新发现的一种主要由脂肪组织分泌的脂肪细胞因子 [ 4 ] ，能与胰岛素受体结合而具有类胰岛素活性，与肥胖及胰岛素抵抗密切相关 [ 5 ] 。Dahl 等 [ 6 ] 研究发现，在不稳定心绞痛患者颈动脉和冠状动脉粥样硬化斑块的富含脂质区，泡沫细胞和巨噬细胞中 Visfatin 均呈高表达，提示可能与粥样斑块的形成与破裂有关。众多研究表明，血管内皮细胞中的 Visfatin 可通过诱导炎症因子，如单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）等的表达 [ 7 - 9 ] ，参与动脉粥样硬化的炎症过程，进而导致粥样硬化斑块的不稳定性及坏死性凋亡（Necroptosis）诱发的内皮功能障碍 [ 6 ] ，但 Visfatin 在动脉粥样硬化发生发展中的具体作用尚不清楚。
动脉粥样硬化是一个慢性炎症过程，而血管内皮细胞损伤及功能紊乱是引起血管炎症反应、启动动脉粥样硬化的关键因素 [ 10 ] 。LOX-1 是一种广泛表达于血管内皮细胞的Ⅱ型膜蛋白，也是介导内皮细胞对氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，OxLDL）等促炎物质进行摄取和降解的主要受体，与动脉粥样硬化的发生、发展密切相关 [ 11 ] 。LOX-1 的表达受多种促炎因子、促氧化剂和机械刺激等因素调控，如 Ox-LDL、血管紧张素-Ⅱ（angiotensin-Ⅱ，Ang-Ⅱ）、TNF-α 和流体切应力等 [ 12 - 13 ] 。目前研究表明，LOX-1 的异常表达是引起炎症反应、Necroptosis 诱发的内皮功能障碍及动脉粥样硬化发生的重要因素 [ 14 ] ，但 Visfatin 与 LOX-1 之间的关系及其在动脉粥样硬化发展中的作用尚未阐明。
为此，本研究将利用细胞生物学、分子生物学、免疫化学等方法来观察 Visfatin 对血管内皮细胞中炎症反应及 Necroptosis 的影响，并探讨 LOX-1 在其中的作用，以期为动脉粥样硬化等心血管疾病的防治提供新的靶点。
1. 材料与方法
1.1. 材料和试剂
M199 培养基、胰蛋白酶、TRIzol 购自美国 Invitrogen 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国 Hyclone 公司；RT-PCR 试剂盒、SYBR/Eva Green® Real-time PCR Master Mix 购自日本 TOKOBO 公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自美国 Pierce 公司；人 MCP-1 ELISA 试剂盒购自美国 R&D 公司；小鼠抗 β-actin 抗体、兔抗 LOX-1 多克隆抗体（H-140）购自美国 Santa Cruz 公司；兔抗 MCP-1 多克隆抗体购自武汉博士德公司；辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG（ZF-2305）、辣根酶标记山羊抗兔 IgG（H＋L）（ZF-2301）、FITC 标记山羊抗兔 IgG（H＋L）（ZF-0311）购自北京中杉金桥公司。其余试剂均为市售分析纯产品。
1.2. 实验方法
1.2.1. 细胞分离及培养
无菌条件下取剖宫产术后的健康胎儿脐带（15～20 cm，离体时间小于 4 h），置入 4℃ 的 PBS 缓冲液（含 100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素）中并将该脐静脉冲洗干净。0.1% Ⅱ型胶原酶灌注静脉，于 37℃ 孵箱中孵育 20 min 后轻按脐静脉外部使内皮细胞脱落。吸取消化液，加入等量含 10% FBS 的 M199 培养基终止酶反应。1 500 r/min 离心 10 min，弃上清，沉淀即为分离出的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）。
HUVECs 用含 15%～20% FBS、20 µL/mL 内皮细胞生长添加剂（ECGS）的 M199 培养基，于 37℃、5% CO 2 的培养箱（湿度 100%）静置培养。细胞密度达 90% 后，采用胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞进行后续实验。
1.2.2. 实验分组
取对数生长期细胞，在 M199 基础培养基（含 1% FBS 及 1% BSA）饥饿 6 h 后进行干预。对照组不施加任何处理。干预措施包括：① 分别用 100 nmol/L AngⅡ、100 ng/mL Visfatin、16 µg/mL 或 10 ng/mL Leptin 刺激 24 h；② 250 µg/mL Polyinosinic acid（LOX-1 抑制剂）预处理 1 h 后，再加入 100 ng/mL Visfatin 刺激 24 h；③ 10 µmol/L Necrostatin-1（Necroptosis 抑制剂，Nec-1）预处理 3 h 后，再加入 100 ng/mL Visfatin 刺激 24 h；收集细胞总 RNA、蛋白或上清液进行实验。
1.2.3. 荧光定量 RT-PCR 测定基因表达变化
采用 TRIzol 试剂按操作说明书步骤提取细胞总 RNA，并用紫外分光光度仪测定 RNA 浓度。将 1.5 µg 总 RNA 逆转录为互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）后完成 PCR 荧光定量检测。反应条件为：94℃ 预变性 2 min，94℃ 变性 10 s，58℃ 退火 10 s，72℃ 延伸 15 s，共 40 个循环。所用引物序列如 表 1 所示，β-actin 为内参基因。
表 1
Primer sequences for real-time PCR
RT-PCR 所用引物序列
1.2.4. Western blot 测定蛋白表达变化
细胞进行相应处理后，使用 RIPA 蛋白裂解液收集细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，沸水煮 5 min 变性。取等量蛋白（40 μg）上样，经 SDS-PAGE 电泳后，将蛋白转至 PVDF 膜上，封闭后 4℃ 摇床孵育一抗（LOX-1，1∶200；MCP-1，1∶200；β-actin，1∶2 000）过夜，TBST 洗 3 次，室温孵育二抗（1∶5 000）1 h，增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）显影并通过凝胶成像仪观察蛋白的表达情况。
1.2.5. 免疫细胞化学法检测蛋白表达变化
接种细胞于 6 孔板中盖玻片上，待细胞达 70%～80% 融合时，多聚甲醛固定 30 min。脱蜡、水化后，PBS 洗三次，3% H 2 O 2 （80% 甲醇）室温孵育 10 min。进行抗原修复后滴加正常山羊血清室温封闭 20 min，一抗（37℃ 1 h）、二抗（37℃ 1 h）孵育，后滴加链霉亲和素-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP），37℃ 孵育 1 h，DAB 显色、苏木精复染、脱水、透明、封片、镜检。
1.2.6. 酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测上清液中蛋白表达变化
分别收集对照组和干预组细胞培养上清液，按照试剂盒提供步骤进行操作，使用酶标仪（Model1680，Bio-Rad，美国）检测 450 nm 处各孔吸光度（OD）值，进而测定 HUVECs 上清液中 MCP-1 蛋白含量。
1.2.7. MTT 法检测细胞增殖
将 HUVECs 细胞按 1 × 10 4 /孔接种于 96 孔板中，给予不同处理后，向每孔加入 MTT 溶液（5 mg/mL）20 μL，继续孵育 4 h。后各再加入 150 μL 二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO），振荡 10 min 使之充分溶解，使用酶标仪检测 570 nm 处各孔吸光度 A 值。细胞增殖率（或抑制率）=［（对照组 A570 − 空白孔 A570） − （实验组 A570 − 空白孔 A570）］/（对照组 A570 − 空白孔 A570） × 100%。
1.2.8. 透射电镜观察 HUVECs 超微结构
将对照组和干预组细胞进行消化后，300 g 离心 5 min，取细胞沉淀，依次加入 2.5% 戊二醛、1% 四氧化锇固定，50%、70%、90%、100% 乙醇进行梯度脱水，置于丙酮和纯 812 树脂混合液（1∶1）中 40℃ 浸透 30 min。然后，浸入纯 812 树脂中包埋，切片，醋酸铀/柠檬酸铅双染后置于透射电镜（H7650，Hitachi，日本）下观察。
1.2.9. 流式细胞化学法检测细胞周期及凋亡
将对照组和干预组细胞进行消化后，800 r/min 离心 15 min，收集细胞，PBS 洗 2 次。于 70 % 乙醇中 4℃ 固定过夜。再次离心，收集固定细胞并加入适量 PBS 使之重悬，依次加入 RNase-A（50 µg/mL，37℃ 水浴 30 min）和 PI（65 µg/mL，冰浴避光染色 30 min），过滤后使用流式细胞仪（Invitrogen，美国）检测细胞周期及凋亡情况。
1.2.10. 统计学分析
实验数据以均数 ± 标准差表示，采用 SPSS 17.0 软件分析处理，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA ），组间比较采用 LSD 法。 P < 0.05 表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. Visfatin 诱导 HUVECs 中 LOX-1 蛋白和基因表达
采用倒置相差显微镜观察 HUVECs 细胞形态，如 图 1a 所示，HUVECs 呈扁平、多角形，单层铺路石状排列。细胞核呈椭圆形，位于细胞的中央，有 1～3 个核仁。
Visfatin induced the expression of LOX-1 in HUVECs
Visfatin 刺激诱导 HUVECs 中 LOX-1 的表达
a. photographs of cultured HUVECs (scale bar = 100 μm); b-c. the mRNA (b) and protein (c) expression of LOX-1; d. the expression of LOX-1 in HUVECs detected by immunocytochemistry. * P < 0.05 vs control, # P < 0.05 vs visfatin, n = 3
a. 分离培养的 HUVECs，图中标尺 = 100 μm；b-c. LOX-1 的基因（b）和蛋白（c）表达；d. 免疫细胞化学法检测 HUVECs 中 LOX-1 的蛋白表达。 * P < 0.05 vs control， # P < 0.05 vs visfatin， n = 3
为探究 Visfatin 对 LOX-1 表达的影响，我们采用 100 ng/mL 的 Visfatin 对细胞进行预处理，并以 100 nmol/L AngⅡ为阳性对照，通过 RT-PCR、Western blot 等方法检测 LOX-1 的表达变化。实验结果显示，与对照组相比，100 ng/mL 的 Visfatin 作用 HUVECs 24 h 后，可显著上调 LOX-1 的 mRNA 和蛋白表达水平（ P < 0.05）（见 图 1b-c ）。免疫细胞化学检测法结果显示，与对照组相比较，100 ng/mL Visfatin 作用 24 h 能明显上调 HUVECs 中 LOX-1 蛋白（图片中蓝色为细胞部分，红色为 LOX-1 蛋白表达部分）的表达（见 图 1d ）。
2.2. LOX-1 介导 Visfatin 诱导 HUVECs 中 MCP-1 蛋白和基因表达
研究表明，Visfatin 具有促进炎症因子分泌、参与机体炎症应答、延缓中性粒细胞凋亡等作用 [ 5 , 9 ] 。如 图 2a 、 c 所示，与对照组相比，100 ng/mL 的 Visfatin 作用 24 h 能够显著上调 HUVECs 中 MCP-1 的 mRNA 和蛋白表达水平。此外，Visfatin 作用后细胞培养上清液中分泌的 MCP-1 蛋白也出现明显上调（见 图 2b ）。说明 Visfatin 可以促进 HUVECs 中炎症因子 MCP-1 的表达。
Visfatin promoted the expression of MCP-1 via LOX-1 in HUVECs
Visfatin 通过 LOX-1 促进 HUVECs 中炎症因子 MCP-1 的表达
a & c. the mRNA (a) and protein (c) expression of MCP-1; b. the expression of MCP-1 secreted by HUVECs detected by ELISA. * P < 0.05 vs control, # P < 0.05 vs visfatin, n = 3
a 和 c. MCP-1 的基因（a）和蛋白（c）表达；b. ELISA 法检测 HUVECs 分泌 MCP-1 蛋白的变化。 * P < 0.05 vs control，# P < 0.05 vs visfatin， n = 3
为进一步检测 LOX-1 在 Visfatin 诱导血管内皮细胞中 MCP-1 表达中的作用，我们在 Visfatin 刺激前用 250 µg/mL Polyinosinic acid（LOX-1 特异性抑制剂）对细胞进行 1 h 预处理，结果显示，使用 Polyinosinic acid 后，HUVECs 中 MCP-1 的 mRNA 和蛋白表达较 Visfatin 单独刺激组明显降低（ P < 0.05）（见 图 2a 、 c ）；细胞培养上清液中的分泌 MCP-1 蛋白也显著减少（见 图 2b ）。提示 LOX-1 可能参与介导 Visfatin 上调 HUVECs 中 MCP-1 的表达。
2.3. Visfatin 对 HUVECs 超微结构变化的影响
我们利用透射电镜观察空白对照组及 Visfatin 刺激组 HUVECs 的超微结构的变化，AngⅡ 刺激组作为阳性对照。如 图 3 所示（图片位置上、下为同一刺激组或空白对照），Visfatin 刺激组中，出现部分坏死样形态学特征，如细胞膜完整性的破坏，细胞或细胞器（如线粒体、内质网等）肿胀，甚至崩解，同时核内染色质边聚、细胞核凝聚，但未见明显的形态改变。此外，还观察到部分类似自噬体形态样结构出现。AngⅡ刺激组可见细胞核内染色质边聚，细胞膜完整，线粒体有正常的超微结构，但未见明显凋亡小体。而空白对照组中，均无上述细胞坏死的形态学特征。自噬是 Necroptosis 的普遍下游应答表现 [ 15 ] ，因此，以上结果提示，Visfatin 可能诱导细胞发生了 Necroptosis。
2.4. LOX-1 参与介导 Visfatin 诱导细胞发生 Necroptosis
为深入探究 Visfatin 对细胞发生 Necroptosis 和凋亡的影响及其可能机制，我们应用 RT-PCR 方法对 Visfatin、AngⅡ以及 Leptin 干预后细胞中 Necroptosis 特异性基因 BMF [ 16 ] 和凋亡特异性基因 Caspase3 的基因表达进行检测。如 图 4 所示，与对照组相比，Visfatin 可明显上调 HUVECs 细胞中 BMF 的 mRNA 表达（ P < 0.05），但对凋亡特异性基因 Caspase3 表达则无明显的上调作用。而 AngⅡ、Leptin 16 µg/mL 组可以显著上调 Caspase3 的基因表达（ P < 0.05）。此外，流式细胞化学法检测结果也显示，Visfatin 刺激组中细胞并无明显凋亡峰，AngⅡ刺激组中出现了明显的凋亡峰（见 表 2 ）。说明此浓度的 Visfatin 可诱导细胞发生 Necroptosis，而非凋亡。
表 2
Cell cycle and the apoptosis of HUVECs detected by flow cytometry
流式细胞化学法检测 HUVECs 细胞凋亡及细胞周期
| 分组 | Mean G1 | CV G1 | %G1 | Mean G2 | CV G2 | %G2 | %S | G2/G1 | Chi Sq | Count |
| control | 138.1 | 5.6 | 82.0 | 248.6 | 5.5 | 12.9 | 5.1 | 1.000 | 3.2 | 262 |
| visfatin | 132.5 | 6.5 | 79.9 | 238.4 | 6.5 | 16.5 | 3.6 | 1.000 | 2.6 | 210 |
| AngⅡ | 133.8 | 6.8 | 82.6 | 240.9 | 6.8 | 14.0 | 3.4 | 1.000 | 2.1 | 148 |
| Leptin | 128.6 | 6.7 | 80.6 | 231.5 | 6.7 | 15.4 | 4.0 | 1.000 | 2.2 | 217 |
| Polyinosinic acid+visfatin | 135.2 | 6.0 | 85.7 | 243.4 | 6.8 | 10.1 | 4.2 | 1.000 | 1.4 | 135 |
| Nec-1+visfatin | 146.2 | 6.0 | 78.8 | 263.1 | 6.0 | 16.8 | 4.4 | 1.000 | 1.6 | 198 |
Visfatin induced necroptosis of HUVECs via LOX-1
LOX-1 介导 Visfatin 促进 HUVECs 发生 Necroptosis
the mRNA expression of BMF and Caspase3. * P < 0.05 vs control, # P < 0.05 vs visfatin, n = 3
Necroptosis 特异性基因 BMF 及凋亡相关基因 Caspase3 基因表达. * P < 0.05 vs control， # P < 0.05 vs visfatin， n = 3
进一步实验中我们发现，加用 LOX-1 特异性抑制剂 Polyinosinic acid 或 Necroptosis 特异性抑制剂 Necrostatin-1（Nec-1）后，与单纯 Visfatin 刺激组相比，BMF 的基因表达水平显著降低，而 Caspase3 的表达却出现明显增加（ P < 0.05）（见 图 4 ）。流式细胞化学法结果显示，Polyinosinic acid+visfatin 组中，凋亡峰较 Visfatin 单独刺激组明显（见 表 2 ）。以上结果说明，LOX-1 参与介导 Visfatin 诱导 HUVECs 发生 Necroptosis。
2.5. LOX-1 参与介导 Visfatin 抑制细胞增殖
采用 MTT 法检测不同干预措施对 HUVECs 增殖的影响，结果如 图 5 所示，与对照组相比，Visfatin 组、AngⅡ组和 Leptin 16 µg/mL、Leptin 10 ng/mL 组 HUVECs 细胞增殖均受到显著抑制（ P < 0.05），其中 Visfatin 组作用最为显著。加用 LOX-1 特异性抑制剂 Polyinosinic acid 或 Necroptosis 特异性抑制剂 Necrostatin-1（Nec-1）后，与单纯 Visfatin 刺激组相比，细胞增殖率出现明显回升（ P < 0.05）。
Visfatin induced necroptosis of HUVECs via LOX-1
LOX-1 介导 Visfatin 对 HUVECs 增殖的影响
the proliferation of HUVECs detected by MTT. * P < 0.05 vs control, # P < 0.05 vs visfatin, n = 5
MTT 法检测 HUVECs 细胞增殖。 * P < 0.05 vs control，# P < 0.05 vs visfatin， n = 5
此外，我们采用流式细胞化学法检测 Visfatin 对 HUVECs 细胞周期的影响，结果显示，空白对照组、Visfatin、AngⅡ、Leptin、Polyinosinic acid+visfatin 及 Nec-1+visfatin 组的 S 期分别为 5.1、3.6、3.4、4.0、4.2 及 4.4。与对照组相比，Visfatin、AngⅡ及 Leptin 刺激组细胞 S 期明显降低；而在使用 LOX-1 特异性抑制剂 Polyinosinic acid 或 Necroptosis 特异性抑制剂 Nec-1 预处理细胞后，较单独使用 Visfatin 组，细胞 S 期升高（见 表 2 ）。以上结果均提示，Visfatin 可以抑制细胞增殖，而这种抑制作用可能是通过 LOX-1 介导的，且 Necroptosis 很可能是发生此抑制增殖过程的主要途径。
3. 讨论
动脉粥样硬化是一种常见的慢性心脑血管疾病，以血管内皮细胞内和细胞间大量脂质堆积、单核/巨噬细胞浸润、泡沫细胞形成、血管平滑肌细胞增殖并产生某些炎性因子引起一系列炎症反应等为特征，而炎症反应是动脉粥样硬化过程中典型的病理特征 [ 1 - 2 ] 。内皮细胞受损及功能障碍在动脉粥样硬化的发生发展中扮演着重要的角色，内皮完整性破坏使其对脂蛋白通透性增大，促进脂质迁移和沉积，随后单核/巨噬细胞聚集和平滑肌细胞迁移至内膜，致 T 细胞的活化，并形成泡沫细胞及炎性细胞浸润，形成脂质池，致使管壁损伤加重，从而促进粥样斑块形成，导致动脉粥样硬化的进一步发展 [ 9 ] 。多项研究表明，Visfatin 是一种脂肪细胞因子，与炎症反应密切相关，在多种炎症反应过程中表现活跃并出现升高 [ 17 ] 。本研究也发现 Visfatin 可以诱导内皮细胞 HUVECs 中炎症因子 MCP-1 的表达，参与调控动脉粥样硬化的形成和发展（见 图 2 ）。已知，LOX-1 及某些脂质成分激活血管内皮细胞是动脉粥样硬化发生和发展的重要环节 [ 18 ] ，在动脉粥样硬化早期受损部位及进展期斑块的新生血管内皮/巨噬细胞和平滑肌细胞均可发现 LOX-1 的高表达 [ 19 ] 。LOX-1 可以介导血管内皮细胞摄取 Ox-LDL，通过巨噬细胞清道夫受体途径被巨噬细胞吞噬，形成泡沫细胞并沉积于血管内皮，引起内皮受损及功能紊乱。其中，Visfatin 引起的促炎作用，部分程度上是通过 LOX-1 介导的（见 图 1 、 2 ）。Visfatin 通过诱导血管内皮细胞中 LOX-1 的表达引起炎症，导致内皮细胞损伤及功能紊乱，促进动脉粥样硬化发生与发展的恶性循环。
除了炎症因子，凋亡和坏死也是造成血管内皮细胞损伤及功能紊乱的重要途径。众所周知，凋亡是一个细胞进行自我调控的主动过程，其中 Caspase 激活是调控凋亡发生的关键环节 [ 20 ] 。而 Necroptosis 则是一种由非死亡受体诱导且不依赖于 Caspase 激活的程序性坏死，具有明显的坏死形态及特性，同时可引起一系列炎症反应，导致损伤级联放大，与动脉粥样硬化的发生密切相关。我们的研究显示，Visfatin 可以诱导 HUVECs 发生 Necroptosis，包括坏死性特征的出现（见 图 3 ）以及 Necroptosis 特异性基因 BMF 表达显著增加等（见 图 4 ），进而引起内皮细胞损伤及功能障碍，影响细胞增殖（见 图 5 ），而 LOX-1 很可能是介导这一过程的关键受体。另外，我们观察到 Visfatin 刺激并不能引起 Caspase3 基因表达的明显变化，提示 LOX-1 在 Visfatin 诱导的凋亡途径中可能只发挥了极其微弱的作用。有趣的是，当抑制了 LOX-1 这一调控 Necroptosis 途径后，Caspase3 表达出现显著升高，Visfatin 可能通过其他途径诱导细胞发生凋亡。近来研究也表明，在抑制凋亡的情况下，可以引起 Necroptosis 的发生 [ 21 ] ；而当抑制了 Necroptosis 后，也可能促使凋亡的发生。提示 Necroptosis 与凋亡之间有着极为密切的关系，二者之间可能存在相互转化，是两个相互补充的细胞死亡途径。
综上所述，LOX-1 参与介导 Visfatin 诱导血管内皮细胞发生炎症反应及 Necroptosis，损伤内皮细胞结构及功能，进而促进动脉粥样硬化的发生发展进程。本研究结果有望为探索肥胖与动脉粥样硬化之间的潜在关系提供新的理论基础，也为临床治疗肥胖导致的动脉粥样硬化等心血管疾病提供潜在的靶点。
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
Funding Statement
国家重点研发计划基金资助项目（2017YFB0702503，2017YFC0910004）；四川大学基金资助项目（2018SCUH0063）
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