RT有两种可能，一种是real time (monitors the amplification of a targeted DNA molecule during the PCR, not at its end, as in conventional PCR)；另一种是reverse transcription，即反转录，RNA变cDNA。qRT-PCR（Quantitative Real-time PCR）

CT值：扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数，cycle threshold。Ct值的可信范围：临床研究：小于33；科学研究：小于38；内参基因：小于20，样品间差距不超过1

熔解曲线验证扩增产物特异性，单一产物熔解曲线峰图重叠呈 单峰 （同一产物解链温度相同），若出现双峰说明产物不特异，可能存在引物二聚体或非特异性扩增，则引物可能存在问题。

为了减少检测样本在RNA产量、质量和反转录效率上可能存在的差异，需要选择合适的稳定内参基因作为校正标准，但是迄今为止尚未找到在所有条件下均可稳定表达的内参基因。近年来出现了筛选稳定性好的内参基因的新方法，如使用GeNorm软件、基因芯片据、EST数据库。

内参基因是指其表达水平不受研究条件的影响且可以在多种样本间恒定表达的已知参照基因。用这个基因的表达水平可以准确量化初始材料的载量。由于管家基因的表达水平受环境因素影响较小，并能在生物体几乎全部组织及各个生长阶段持续表达，所以在试验中通常选用管家基因作为内参基因，然而，管家基因在部分不同组织或不同处理条件下其转录水平可能会发生变化，所以，迄今为止尚未找到理想的内参基因。目前进行qRT-PCR定量基因表达的方法主要有两类，即绝对定量法和相对定量法。

绝对定量法能够获得基因表达的准确表达量。但针对不同的目的基因， 需要构建不同的标准品 ，大大增加试验的难度和复杂性。因此，利用qRT-PCR技术测定基因的表达量时。往往不是直接测定目的基因的绝对表达量，而是分别测定目的基因和内参基因的表达量。并把内参基因的表达量作为一个标准来测出目的基因的相对表达量，最后再进行样品间相对表达量的比较。与绝对定量法相比相对定量法简单、准确并且高效，应用十分广泛，但其需要选择合适的内参基因。

在用相对定量法测定基因的表达水平时，还需要考虑数据如何呈现。qRT-PCR得到的CT值是指数关系，不是线性关系，因此不能将CT值直接用于需要数据正态分布的统计分析方法如t检验和方差分析(ANOVA)方法中，所以统计数据时应先将原始CT值进行2-CT转换，使数据达到线性关系后再进行统计分析。在用相对定量法得到数据后，进行数据分析时常用比较CT值法(2-△△CT法)。此方法基于2个假设：①扩增效率为100％，即每个PCR循环产物的量都翻倍，可以通过扩增效率的验证来解决；②有合适的内参基因校正上样量的误差。

qRT-PCR实验流程：提取组织/细胞总RNA，以其中的mRNA为模板，利用逆转录酶反转录成cDNA，再进行PCR扩增，通过计算2^-ΔΔct值获得基因表达量。

R包 - tidyqpcr （ https://github.com/ropensci/tidyqpcr ）

Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) is a highly adaptable experimental technique used across biology and medicine to measure the amounts of nucleic acids (DNA or RNA). tidyqpcr is a software package for qPCR data analysis that builds on the tidyverse collection of data science tools in the R programming language.

protocol

• RNA isolation phase (w/ RNEasy Plus Mini Kit): 【the same as RNA-seq, need at least 2 replicates, better three】
o Every step at room temperature
o Gather sample (cell, organoid) (< 1x10^7 cells/sample).
o Lyse directly or trypsinized and collected as a cell pellet by adding 400 uL Buffer RLT Plus and keep it in 1.5 mL tube
If organoid, use P1000 pipette tip to break up organoid and do a swirling motion “beating an egg.”
o Homogenize the lysate by vortexing for 1 min
>> Pause point: -20oc or -80oc for several months
o Transfer lysate to purple gDNA Eliminator Spin Column. Pipette up and down until foamy.
o Centrifuge for 30s at 8000g. Save Flow-Through (/FT). Discard column.
*All centrifuge at 20-25*c (not cool below 20*c)
o Add 350 uL of 70% EtOH to FT. Mix and immediately transfer 700 uL of FT to the pink RNEasy Spin Column.
o Close lid & Centrifuge for 15s at 8000g. Discard FT. Save column.
o Add 700 uL Buffer RW1 to the same pink column.
o Close lid & Centrifuge for 15s at 8000g. Discard FT. Save column.
o Add 500 uL Buffer RPE to the same pink column.
o Close lid & Centrifuge for 15s at 8000g. Discard FT. Save column.
o Add 500 uL Buffer RPE to the same pink column.
o Close lid & Centrifuge for 2min at 8000g. Discard FT. Save column.
o Dry column for 2min.
o Place pink column in a new 1.5-mL Eppendorf tube for elution.
o Add 35-60 uL dw directly onto the membrane
o Close lid & Centrifuge for 1min at 8000g to elute RNA.
o Measure [RNA] with NanoDrop.
o Store RNA at 4 C until further use.

• 5RT with BioRad’s iScript 5x MM
o Dilute RNA to 1000ng or 1500 ng in PCR strip  Total Volume 8uL
o Add 2uL 5x MM to make it to 10uL

o PCR iScript for (5+20+1+99=26 min)

• qPCR phase (ddCT):
o Formula for each well:
 5 uL 2X PowerSYBR Green MM
 0.2 uL 10uM primer mix
 0.2 uL RT product/template
 4.6 uL dw
o Step 1: Plate Planning
 Suppose: 5 samples, 10 genes
 Mixtures: SYBR MM + Template; dw + primer (not waste more SYBR!)
 Prepare 5 tubes in strip for 5 templates (dist. horizontally)
• Each tube has enough for 10 -> 15 rxns
 Prepare 10 tubes in strip for 10 genes (dist. vertically)
• Each tube has enough for 5 -> 10 rxns
o Step 2: Volume Planning
 SYBR MM + Template Mixture:
• SYBR MM: 5 uL x 15 rxns = 75 uL
• Tempalte: 0.2 uL x 15 rxns = 3 uL
• Total = 78 uL per PCR tube
• Distributing horizontally 5.2 uL per well
 Dw + Primer Mixture
• Primers: 0.2 uL x 10 rxns = 2 uL
• Dw: 4.6 uL x 10 rxns = 46 uL
• Total = 48 uL per PCR tube
• Distributing vertically 4.8 uL per well
o Step 3: Doing it!
 Distribute with the electronic multi-channel pipette
 Each tip has a max volume of 30 uL

PCR - 聚合酶链式反应

The Complete Guide to PCR (How it Works, Primer Design, and Running Reactions) - YouTube

目的：从DNA双链中扩增出感兴趣的区段，用于后续的研究。

原理：DNA结构，双螺旋，AT、GC配对；DNA双链在临界温度会解链，退火后又会恢复；引物，DNA复制的起点，之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶只能把新的核苷酸加到已有的DNA链上。

操作核心： wiki上很全面

1. 引物设计，会考虑GC含量，决定退火温度；

2. 变性、退火和延伸；

PCR的应用 - PCR Applications—Top Seven Categories

RT-PCR 逆转录聚合酶链式反应 - 分析的是RNA，大部分是基因表达

逆转录PCR，就是PCR的一个常规应用，我也跑过，见过庞大的机器，也是先设计引物，然后提cDNA，定量。

一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板透过PCR进行DNA复制。

PCA我们是扩增DNA序列，而RT-PCR我们扩增的是反转录出来的cDNA序列，然后再做PCR，把量做上去来检测，通常会配上一些管家基因作为对照。

RT-PCR的数据分析可以参照Y数微信公众号，代码很详细。

qPCR (Quantitative Real-time PCR) 实时荧光定量PCR - 分析的是DNA

实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。