Abstract

Abstract

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率也居恶性肿瘤首位。既往治疗主要是以铂类为基础的双药化疗，但传统化疗不良反应多且疗效有限。免疫治疗开启了肿瘤治疗的新时代，为肿瘤的治疗模式带来了革命性改变。尽管免疫治疗已经取得突破性进展，但仅有一部分患者产生应答并从中持久性获益。在NSCLC中，不区分治疗人群，免疫治疗的客观缓解率（objective response rate, ORR）在20%左右 ^{[ 1 , 2 ]} ，即使在程序性细胞死亡配体1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）表达大于50%的人群中，ORR也不到50% ^{[ 3 , 4 ]} 。因此，为了更好地提高免疫治疗疗效，达到精准治疗的目的，肿瘤免疫治疗生物标志物的研究和探索备受重视。本文聚焦NSCLC免疫治疗相关的生物标记物，并对近年NSCLC免疫治疗生物标志物研究现状和进展进行综述，以便对其有更加深入、更加全面的认识，为免疫治疗的临床实践提供参考。

1. PD-L1表达

PD-L1是一种免疫检查点分子，与T细胞表面的程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death-1, PD-1）结合后可以抑制T细胞的激活，使肿瘤细胞发生免疫逃逸，促进肿瘤发展 ^{[ 5 ]} 。多项临床研究 ^{[ 4 , 6 , 7 ]} 表明，PD-L1的表达与NSCLC患者的ICIs治疗结局相关。Keynote-024和Keynote-042研究均为多中心、Ⅲ期随机对照试验，旨在比较Pembrolizumab与含铂化疗在无表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR ）、间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK ）驱动基因突变的初治NSCLC中的疗效。Keynote-024研究 ^{[ 4 , 8 ]} 将PD-L1肿瘤细胞阳性比例分数（tumor proportion score, TPS）≥50%患者纳入研究，与含铂化疗组相比，Pembrolizumab组具有更高的ORR（44.8% vs 27.8%）、更长的无进展生存期（progression-free survival, PFS）（10.3个月 vs 6.0个月；HR=0.50，95%CI：0.37-0.68）和总生存期（overall survival, OS）（30.0个月 vs 14.2个月；HR=0.63，95%CI：0.47-0.86）。2020年欧洲肿瘤内科学会（European Society for Medical Oncology, ESMO）年会上，Keynote-024研究 ^{[ 9 ]} 5年OS数据进行了更新，相较于化疗组，Pembrolizumab组具有更长的OS（26.3个月 vs 13.4个月），5年OS率也显著高于化疗组（31.9% vs 16.3%）。Keynote-024试验的结果也使得美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准Pembrolizumab作为驱动基因突变阴性且PD-L1 TPS≥50%的晚期NSCLC一线治疗方案。Keynote-042 ^{[ 3 ]} 将纳入研究人群拓展至PD-L1 TPS≥1%，研究结果显示Pembrolizumab组比化疗组具有更长OS（16.7个月 vs 12.1个月；HR=0.81，95%CI：0.71-0.93）；亚组分析发现PD-L1 TPS≥50%组OS获益显著（20个月 vs 12.2个月；HR=0.69，95%CI：0.56-0.85）；TPS 1%-49%亚组中，Pembrolizumab组OS未见明显获益。Pembrolizumab组内PD-L1 TPS≥50%的患者占比较高（299/637）及该群体较好的OS获益可能是整体分析中Pembrolizumab组OS获益的重要原因。Keynote-042研究进一步证实并巩固了Pembrolizumab在PD-L1高表达晚期NSCLC一线治疗地位；对于PD-L1 TPS 1%-49%的患者，Pembrolizumab单药治疗并不是一线治疗的最佳选择。

IMpower131将既往未经治疗的鳞状NSCLC患者按1:1:1的比例随机分配至Atezolizumab+卡铂/紫杉醇（A+CP）组、Atezolizumab+卡铂/白蛋白结合型紫杉醇（A+CnP）组、卡铂/白蛋白结合型紫杉醇（CnP）组。在PD-L1高表达亚组中，相较于CnP组，A+CnP组患者具有更长的PFS（10.1个月 vs 5.1个月；HR=0.41，95%CI：0.25-0.68）和OS（23.4个月 vs 10.2个月；HR=0.48，95%CI：0.29-0.81）。在PD-L1低表达和阴性亚组中A+CnP未见明显PFS和OS获益 ^{[ 7 ]} 。该研究数据表明，仅有PD-L1高表达亚组患者接受免疫联合化疗后PFS和OS可获益。

尽管PD-L1是FDA批准的首个用于ICI治疗的预测性生物标志物，其在临床应用中仍面临一些挑战。Checkmate017/057的研究结果，使Nivolumab被FDA批准用于NSCLC的二线治疗。与PD-L1 TPS≥1%的NSCLC患者可以从Pembrolizumab一线单药治疗获益不同，无论患者PD-L1表达与否，均能从Nivolumab二线单药治疗获益 ^{[ 10 ]} 。OAK研究 ^{[ 11 ]} 比较Atezolizumab与多西他赛在既往接受过治疗的NSCLC患者中的治疗效果，纳入患者不限病理类型和PD-L1表达状态。研究表明，无论PD-L1表达状态如何，Atezolizumab组均具有更长的OS。Keynote-189研究结果 ^{[ 12 ]} 显示，任何PD-L1表达状态下，非鳞NSCLC患者均能从Pembrolizumab联合化疗中获益。PD-L1表达对不同ICI、免疫单药或免疫联合化疗疗效预测具有不一致性，使其临床应用受到一定限制。除此之外，PD-L1的检测尚未标准化，有多种平台、多种抗体用于PD-L1检测，不同平台采用不同的评分系统评估PD-L1表达水平，且无严格的标准界定PD-L1的阴性和阳性 ^{[ 13 ]} ，而且，病理学家对PD-L1表达的评分在不同观察者之间的重复性较差 ^{[ 14 ]} 。免疫组化（immunohistochemistry, IHC）是评估肿瘤组织PD-L1表达最常用的方法，但PD-L1的表达是一个动态过程，受γ干扰素（interferon-γ, IFN-γ）、化疗和放疗等多种因素影响 ^{[ 15 ]} ，IHC不能有效反映该过程；同时，PD-L1的表达除了在肿瘤组织内存在异质性，不同转移部位表达也存在异质性，肾上腺、肝脏和淋巴结转移灶中表达最高，而骨和脑转移灶中表达较低。因此，IHC并不能反映肿瘤组织真实的PD-L1表达状态 ^{[ 16 ]} ，影响了PD-L1预测准确性。据报道，IHC的预测准确率 < 30% ^{[ 17 ]} 。不同部位PD-L1表达水平的预测价值也不同，肺或远处转移灶中PD-L1的表达水平与临床获益呈正相关，而在淋巴结转移灶的PD-L1表达水平与临床获益无关 ^{[ 18 ]} 。

2. 肿瘤突变负荷（tumor mutation burden, TMB）和肿瘤新抗原

3. T细胞炎性基因表达谱（gene expression profile, GEP）

GEP是与抗原呈递、趋化因子表达、细胞毒活性等相关的基因表达谱，可以更加全面地反映肿瘤微环境的免疫状况 ^{[ 35 ]} 。GEP与Pembrolizumab疗效间的关系是Keynote-028研究的探索性终点之一，结果表明，高T细胞炎性GEP患者具有更好的临床获益，当TMB联合GEP或PD-L1可以更好地预测免疫获益人群 ^{[ 36 ]} 。POPLAR研究 ^{[ 37 ]} 的探索性分析显示接受Atezolizumab治疗的患者中，效应T细胞相关基因和IFN-γ相关基因高表达的群体具有更长的OS。

4. 基因突变相关标志物

分子靶向治疗是 EGFR 或 ALK 敏感突变患者的标准治疗。尽管口服EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI）可使患者明显获益，但最终仍因不可耐受的毒副作用或进展停止治疗。既往的试验 ^{[ 38 , 39 ]} 表明，二线单药免疫治疗在 EGFR / ALK 突变亚组无明显生存获益。Toki等 ^{[ 40 ]} 研究表明， EGFR 突变样本中PD-L1表达低，即使肿瘤微环境中存在淋巴细胞，大部分也为无活性TIL。 EGFR / ALK 突变患者还具有较低的TMB。低TMB、PD-L1及CD8 ⁺ TIL可能是 EGFR / ALK 突变患者对免疫治疗应答低下的原因 ^{[ 41 , 42 ]} 。IMpower150研究 ^{[ 43 ]} 是一项随机、开放标签设计的3期临床试验，在EGFR敏感突变亚组中，与BCP（贝伐珠单抗+卡铂+紫杉醇）相比，Atezolizumab+BCP改善了OS。因此，针对 EGFR / ALK 突变的NSCLC患者，在分子靶向治疗失败后是否使用免疫治疗，以及免疫治疗与其他治疗方式间如何组合都需要更深的研究。

KRAS 是最常见的致癌因子之一，在肺腺癌中， KRAS 常与抑癌基因 TP53 或 SKT11 发生共突变。 KRAS 或 TP53 突变的NSCLC表达更高水平PD-L1，可以从抗PD-1治疗中获益， KRAS / TP53 共突变的患者获益更为显著 ^{[ 44 ]} 。 KRAS 基因突变存在多种亚型，各突变亚型与免疫治疗相关性并不一致。癌症基因图谱（the Cancer Genome Atlas, TCGA）数据库分析显示， KRAS G12D/TP53共突变组PD-L1表达水平和免疫细胞浸润水平明显降低，因此， KRAS G12D/TP53共突变可能是肺腺癌患者抗PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂的阴性预测标志物 ^{[ 45 ]} 。

SKT11在细胞代谢、细胞生长和调节细胞极性等方面发挥重要作用。 SKT11 突变与“冷”肿瘤免疫微环境形成相关， SKT11 / LKB1 突变的肿瘤组织内细胞毒性CD8 ⁺ T淋巴细胞浸润减少 ^{[ 46 ]} 。在接受ICIs治疗的 KRAS 突变肺腺癌患者中，相较于SKT11野生型， SKT11 突变患者PFS和OS更短，动物实验进一步证实SKT11缺失促进PD-1/PD-L1抑制剂耐药 ^{[ 47 ]} 。Ricciuti等 ^{[ 48 ]} 的研究也表明 SKT11 突变与 KRAS 突变肺腺癌患者较差的免疫治疗结果相关。因此， SKT11 突变可能是免疫治疗阴性预测标志物。

KEAP1 也是一种抑癌基因，既往的研究 ^{[ 49 , 50 ]} 表明 KEAP1 基因的改变会引起氧化应激通路的失调，从而导肿瘤耐药和放疗抵抗。Chen等 ^{[ 51 ]} 分析了泛癌种中 KEAP1 突变与免疫治疗结局的关系， KEAP1 突变患者OS明显缩短，尽管 KEAP1 突变与高TMB相关，但也引起肿瘤内CD8 ⁺ T淋巴细胞浸润较少，提示其与“冷”肿瘤免疫微环境的形成相关。另一项真实世界研究 ^{[ 52 ]} 也表明KEAP1突变是免疫治疗预后不良标志物。Ricciuti等 ^{[ 48 ]} 研究也显示 KEAP1 突变与 KRAS 突变的肺腺癌患者较差的免疫治疗结果相关。

DNA损伤应答修复（DNA damage response and repair, DDR）基因在DNA损伤修复过程中发挥重要作用。DDR改变造成基因组稳定性降低，增加肿瘤TMB，增强了肿瘤免疫原性 ^{[ 41 ]} 。研究 ^{[ 53 ]} 显示，接受免疫治疗的NSCLC中，DDR突变患者具有更好的ORR以及更长的PFS和OS。表明DDR突变预示更好的免疫治疗疗效。

POLE 基因编码的DNA聚合酶ε和 POLD1 基因编码的DNA聚合酶δ1对DNA复制的校正和保真至关重要。 POLE 和 POLD1 基因突变可引起DNA损伤修复功能缺陷，造成更多基因突变的发生 ^{[ 54 ]} 。一项泛癌种研究 ^{[ 55 ]} 发现， POLE / POLD1 突变与更高的TMB相关，接受免疫治疗的 POLE / POLD1 突变患者也具有更长的OS。因此， POLE / POLD1 突变是免疫治疗潜在预测生物标志物。

超进展（hyperprogressive disease, HPD）是指患者接受免疫治疗后出现肿瘤加速生长的现象，常伴有生存质量下降和较差的预后。 MDM2 / MDM4 扩增、 EGFR 扩增、11号染色体上 CCND1 、 FGF3 、 FGF4 、 FGF19 扩增可以加速肿瘤生长，与HPD的发生存在明显相关性 ^{[ 56 , 57 ]} 。因此，上述基因突变存在的情况下，是否选用免疫治疗需更加谨慎。

5. 外周血生物标志物

外周血抽取容易，侵入性低，使得外周血生物标志物极具吸引力。中性粒细胞淋巴细胞比（neutrophilto-lymphocyte ratio, NLR）是指中性粒细胞绝对数与淋巴细胞绝对数的比值，在全血细胞计数后即可获取，目前已引起极大的关注。高中性粒细胞浸润但低淋巴细胞浸润的肿瘤微环境可促进血管生成、抑制细胞凋亡，从而促进肿瘤的发展。在接受免疫治疗的晚期NSCLC患者中，基线高NLR是一个不良预后因素 ^{[ 58 - 60 ]} 。除了与预后相关外，NLR还可以作为一种预测标志物，对二线使用Nivolumab的NSCLC患者进行回顾性分析发现，NLR升高的患者治疗失败时间更短 ^{[ 61 ]} 。因此，NLR可以用于预测免疫治疗反应。除了NLR，血小板淋巴细胞比（platelet-to-lymphocyte ratio, PLR）、相对嗜酸性粒细胞计数（relative eosinophil count, REC）、相对淋巴细胞计数（relative lymphocyte count, RLC）、LDH等都被认为与免疫治疗疗效相关 ^{[ 62 ]} 。

可溶性PD-L1（solubale PD-L1, sPD-L1）是PD-L1的一种剪切变异体，其没有跨膜结构域。肿瘤患者血浆中sPD-L1高于健康人。sPD-L1可以诱导免疫抑制，sPD-L1的存在介导PD-L1抑制剂耐药 ^{[ 63 ]} 。接受免疫治疗的患者中，高sPD-L1亚组PFS和OS明显比低sPD-L1亚组短，多因素分析提示高sPD-L1是独立的预后不良因素 ^{[ 64 , 65 ]} 。sPD-L1可作为免疫治疗疗效预测和预后的标志。

6. 肠道微生物

人体肠道中存在的细菌、病毒、真菌等微生物共同构成了肠道菌群，肠道菌群大多数与人体呈共生关系，与机体相互作用，维持着肠道内的稳态，在机体免疫反应中发挥重要作用 ^{[ 66 ]} 。近年来研究表明肠道菌群组成可以影响免疫治疗的疗效。Katayama等 ^{[ 67 ]} 研究表明，接受ICI治疗的NSCLC患者肠道内乳酸菌属和梭菌丰度越高，治疗失败时间（time to failure, TTF）越长，对ICI治疗产生应答的患者肠道菌群种类更加多样。Jin等 ^{[ 68 ]} 对接受抗PD-1治疗的中国晚期NSCLC患者肠道菌群与临床结局的关系展开研究，结果显示肠道微生物群的多样性与抗PD-1治疗良好反应具有明显相关性，长双歧杆菌、普氏菌和 Alistipes putredinis 富集的患者具有更长的PFS。Routy等 ^{[ 69 ]} 研究显示，免疫治疗前肠道内 Akkermansia muciniphila 数量多的患者对免疫治疗具有更好的应答，在接受免疫治疗前或治疗期间使用过抗生素的患者PFS明显缩短。小鼠模型中，对ICIs有反应的肿瘤患者的粪便微生物移植到无菌或抗生素治疗的小鼠中，可以改善PD-1抑制剂的抗肿瘤效果。而对ICIs无反应患者的粪便微生物移植则无该效应，口服补充 Akkermansia muciniphila 使其再定植后，可以恢复PD-1抑制剂的抗肿瘤疗效。肠道菌群的多样性与菌种差异使肺癌患者对免疫治疗具有不同反应，这可能与肠道菌群影响免疫细胞功能、诱导免疫细胞浸润相关。

7. 总结

免疫治疗的出现，进一步丰富了肿瘤治疗手段，也开启了晚期NSCLC治疗的新模式。虽然围绕免疫治疗生物标志物进行了许多研究，但仍面临诸多挑战。例如，虽然PD-L1和TMB与免疫治疗疗效存在相关性，但并非所有PD-L1高表达或高TMB患者对免疫治疗应答，而一些PD-L1低表达、不表达或低TMB患者仍能从免疫治疗中获益。单一生物标志物都存在不同程度的不足，会影响免疫治疗获益人群筛选的准确性。因此，通过多种生物标志物联合使用，构建稳定有效的免疫治疗预测模型并寻找更为有效的治疗模式，使接受免疫治疗的患者临床获益最大化，促进肿瘤免疫治疗向精准治疗方向迈进。

References